Projeto e Construção de um Microscópio de Fluorescência de Lâmina de Luz Personalizável, de Objetiva Única para a Visualização de Redes de Citoesqueleto

1. Preparação para o alinhamento Antes de iniciar a construção, realize todas as revisões de literatura necessárias para ter uma ideia clara do caso de uso pretendido (por exemplo, os fluoróforos a serem fotografados, o volume de imagem necessário, os requisitos de resolução). Em particular, consulte a seção de resultados representativos abaixo para decidir se seguir o design exato descrito aqui é apropriado. Se estiver, pule para a etapa 1.2. Caso contrário, encontre sugestões e orientações para a seleção de hardware no Sheunglab SOLS Build Guide23.NOTA: O usuário pode encontrar mais informações sobre as especificações deste sistema específico na seção de discussão. Colete todos os componentes ópticos, optomecânicos e elétricos necessários, conforme detalhado na Tabela de Materiais. Para usuários modificando o sistema, colete todas as partes equivalentes. Construa o laser de alinhamento conforme ilustrado na Figura 2A. Verifique se a viga está colimada usando a placa de cisalhamento. Construa a gaiola de alinhamento de disco de vidro fosco duplo conforme ilustrado na Figura 2B. Preparar a amostra de teste revestida com corante fluorescente.Crie uma solução saturada de corante de rodamina adicionando gradualmente 1 mL de água destilada a 0,2 g de pó liofilizado até que esteja tudo dissolvido. Vórtice para homogeneizar.NOTA: Esta solução é sensível à luz. Embora não haja precauções necessárias durante a preparação, certifique-se de que a solução seja armazenada em uma área escura depois de ter sido preparada.CUIDADO: Use sempre luvas e máscara ao manusear o pó de rodamina. Pipetar 10 μL para o centro de uma lâmina de teste. Coloque um vidro de cobertura de 22 mm x 22 mm sobre o líquido, garantindo que a camada de fluorescência seja a mais fina possível. Selo com esmalte transparente.Observação : este exemplo é sensível à luz. Para maximizar a vida útil da amostra, certifique-se de que a lâmina esteja armazenada em uma área escura quando não estiver em uso. Prepare a amostra de contas 3D (contas de 1 μm embutidas em gel).Use fita dupla face para criar um canal vertical de 4 a 5 mm de largura em um slide de amostra com três camadas de fita alta. Coloque um vidro de cobertura de 22 mm x 22 mm sobre a fita no centro da corrediça. Pressione firmemente as regiões coladas para garantir uma boa vedação entre a fita e o vidro da tampa. Use uma lâmina de barbear para remover o excesso de fita. Preparar 125 mL de solução saturada de goma gelana adicionando gradualmente água DI a 1 g de goma gelana em pó. Esta solução será sólida à temperatura ambiente e líquida a 65 °C. Introduzir 1 ml de solução de goma gelana num tubo de microcentrífuga. Aqueça um recipiente de água numa placa quente a 65 °C e aqueça o tubo de microcentrífuga até que a goma gelana esteja visivelmente viscosa. Preparar 10 μL de uma diluição de 1:1.000 de contas em solução de goma gelana aquecida. Pipetar cuidadosamente a solução para dentro da câmara até ficar cheia. Use um palito para passar uma pequena quantidade de epóxi em ambos os lados do canal, cobrindo totalmente as aberturas para selar. Para garantir a vedação adequada, inspecione visualmente ambas as extremidades para se certificar de que o epóxi penetrou ligeiramente em cada extremidade do canal. Figura 2: Fotos das ferramentas de alinhamento. (A) Laser de alinhamento colimado. AL1: Lente de alinhamento 1, −50 mm; AL2: Lente de alinhamento 2, 100 mm (B) Gaiola de alinhamento de disco de vidro fosco duplo. Abreviações: RMS CP = RMS placa de gaiola roscada; SM1 CP = placa de gaiola rosqueada SM1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 2. Alinhando o caminho de excitação Esboce o layout do microscópio na superfície da mesa óptica. Meça todas as distâncias com a maior precisão possível.Observação : consulte a Figura 3 para obter a localização dos componentes dentro do sistema. Monte o laser de excitação sobre a mesa. Ajuste duas íris para a altura pretendida do laser e monte-as a 2-3 pés de distância na linha desejada de furos atrás da localização do Espelho 1 (M1). Use essas íris para garantir que o feixe esteja nivelado com a superfície da mesa e centralizado na linha de furos na mesa óptica.NOTA: Use óculos de segurança a laser para proteção ocular e bloqueie quaisquer feixes de laser perdidos com telas de segurança a laser como precaução de segurança. Até que todos os componentes sejam permanentemente apertados, a deriva na ordem de horas é possível. Configure uma íris no ponto mais distante do alinhamento no final de cada dia como uma verificação visual rápida de desvio ao retornar à construção. Vibrações, uma mesa óptica flutuada inadequadamente e correntes de ar são as causas mais comuns de deriva óptica. Monte o obturador laser o mais próximo possível do laser de excitação. Utilize este obturador para bloquear rapidamente a luz laser durante o alinhamento, em vez de ligar e desligar repetidamente o laser. Monte os filtros ND na roda do filtro ND (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 e um slot em branco) e monte após o obturador a laser. Alterne o atuador motorizado para um estágio de translação (TS1) e, em seguida, insira o estágio sob a localização de M1. Certifique-se de que o estágio se traduz axialmente ao longo da mesma linha de furos que a luz laser segue. Defina o palco no meio de sua faixa para a colocação inicial.Nas etapas a seguir, 2.6-2.10, insira os componentes ópticos reflexivos no caminho do feixe, um de cada vez, para direcionar o laser ao longo do caminho conforme desenhado na tabela. Use o par de íris ajustado à altura exata para definir o caminho desejado do feixe de saída e orientar a colocação e o alinhamento de cada elemento refletivo. Para cada elemento, ajuste a altura e a posição do suporte para garantir que o feixe de entrada atinja o centro. Em seguida, gire a base do suporte para direcionar o feixe ao longo do caminho do feixe arrastado na mesa para que ele passe por ambas as íris e ajuste finamente a inclinação do feixe de saída com os botões na parte de trás de cada suporte.NOTA: Depois que cada elemento estiver alinhado à altura correta, adicione um colar deslizante ao poste para fixar a altura. Monte e alinhe o M1 sobre o TS1. Monte e alinhe o dicroico sobre a mesa. Seguindo as instruções do fabricante, conecte o galvo à fonte de alimentação e ao gerador de funções. Monte o galvo de tal forma que o laser incida no centro exato do espelho. Ligue o galvo e, em seguida, pressione e segure o botão AM no gerador de forma de onda para definir a inclinação do espelho para a corrente de 0 V DC (centro do intervalo). Agora, alinhe o galvo às íris. Monte e alinhe o Espelho 2 (M2). Insira o espelho cilíndrico grande no suporte do espelho cilíndrico. Use 1 em hastes de gaiola para conectar um adaptador de gaiola de 30-60 mm acima do espelho 3 (M3). Use os botões no suporte do espelho para achatar a inclinação do espelho M3 para a colocação inicial. Monte a gaiola de alinhamento de vidro fosco duplo no adaptador da gaiola acima de M3; Certifique-se de apertar os parafusos ajustados no adaptador da gaiola que mantêm a gaiola de alinhamento no lugar sempre que ela for usada para alinhamento. Monte M3 na mesa e ajuste a altura e a posição até que o feixe esteja aproximadamente centralizado em ambos os discos de alinhamento de vidro fosco. Grampo M3 à mesa e use um suporte de poste, 3 em poste, braçadeira de 90° e 2 em poste em ambos os lados do M3 para adicionar suporte usando os orifícios colados em ambos os lados do suporte de espelho. Use os botões na parte de trás do espelho para ajustar o feixe.NOTA: Todos os elementos reflexivos no caminho de excitação agora estão definidos e não devem ser tocados. Monte a lente 1 (L1) sobre a mesa. Para todos os posicionamentos iniciais da lente, use um alvo de lente rosqueada para centralizar o feixe de entrada na frente da lente. Ajuste a inclinação e a posição lateral da lente 1 (L1) até que o feixe esteja centrado em ambas as placas de vidro fosco na gaiola de alinhamento acima de M3. Monte a lente 2 (L2) em sua respectiva posição para criar um sistema 4f com L1. Mover L2 axialmente para obter um feixe colimado e usar o laser de excitação e a placa de cisalhamento para verificar a colimação. Ajuste a inclinação e a posição lateral de L2 para centralizar o feixe em ambos os discos de vidro fosco acima de M3. Monte o pinhole em uma montagem de tradução xy. Monte isso em cima de um estágio de tradução 1D para fornecer uma tradução axial fina. Monte o pinhole e o palco em um poste e poste mount, e coloque-o no ponto focal compartilhado entre L1 e L2. Ajuste o orifício manualmente até que a luz laser possa ser vista através do orifício. Monte o sensor do medidor de energia imediatamente após o orifício e use o botão de comprimento de onda no console digital do medidor de energia para selecionar o comprimento de onda do laser de excitação. Ajuste a posição xy do orifício para maximizar a transmissão e obter um perfil de feixe próximo ao TEM00. Em seguida, ajuste o pinhole axialmente com o estágio 1D para maximizar ainda mais a transmissão. Monte a lente 4 (L4) na mesa em sua posição e ajuste a montagem para a altura correta. Ajuste L4 axialmente para que o feixe de excitação seja focado na superfície da luva. Ajuste a inclinação e a posição lateral de L4 para centralizar o feixe em ambos os discos de vidro fosco acima de M3. Monte a lente 3 (L3) na mesa em sua posição e ajuste a montagem para a altura correta. Use o laser de excitação e a placa de cisalhamento para verificar a colimação de L3 e L4. Ajuste a inclinação e a posição lateral de L3 para centralizar o feixe em ambos os discos de vidro fosco acima de M3. Remova temporariamente L3. Monte a lente de varredura 1 (SL1) sobre a mesa e ajuste a distância axial para formar um telescópio colimado com L4, conforme medido com a placa de cisalhamento. Ajuste a inclinação e a posição lateral do SL1 para centralizar o feixe em ambos os discos de vidro fosco acima de M3. Reinsira L3. Monte a lente do tubo 1 (TL1) e use o feixe de excitação e a placa de cisalhamento para colimar SL1 e TL1. Ajuste a inclinação e a posição lateral do TL1 para centralizar o feixe em ambos os discos de vidro fosco acima de M3. Usando um anel adaptador, rosqueie a Objetiva 1 (O1) na placa da gaiola acima de M3. Remova SL1 temporariamente e deixe a viga bater no teto. Ajuste a altura (distância axial) de O1 no sistema de gaiola até que o feixe forme um disco Airy no teto e, em seguida, continue ajustando até que o tamanho do disco seja minimizado. Com o O1 no lugar, monte o estágio da amostra na posição apropriada. Figura 3: Localização dos componentes dentro do sistema SOLS. (A) Layout esquemático do sistema SOLS com todos os componentes rotulados. (B) Foto de cima para baixo do sistema físico SOLS na mesa óptica, excluindo a área do estágio da amostra. (C) Foto de cima para baixo da área do estágio da amostra (extensão para a Figura 3B). O caminho de excitação é mostrado em verde. O caminho de emissão é mostrado em vermelho. Distâncias focais das lentes: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3: 150 milímetros; L4: 100 milímetros; CB1: 75 mm; TL1: 200 mm; CB2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 milímetros. Consulte a Tabela de materiais para obter especificações mais detalhadas da peça. Abreviaturas: SOLS = folha luminosa de objetivo único; Roda ND = roda de filtro de densidade neutra variável; L1-L4 = plano concôncavo acromático; CL1-CL3 = lentes cilíndricas; M1-M3 = espelhos; ST1-ST2 = etapas da tradução; DM = espelho dicroico; Galvo = galvanômetro de varredura; SL1-SL2 = lentes de varredura; TL1-TL2 = lentes de tubo; O1-O3 = objetivos; EF = filtro de emissão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Alinhamento da trajetória de emissão Configure o laser de alinhamento.Monte duas placas de gaiola vazias ao lado do laser de excitação na mesma altura que o laser. Use essas placas de gaiola para montar o laser de alinhamento deslizando as hastes da gaiola do laser de alinhamento nos orifícios vazios nas duas placas de gaiola. Certifique-se de que o laser pode ser ajustado para a posição ligada, tocando ao redor do botão liga/desliga ou conectando um interruptor liga/desliga. Remova o O1 e reinsira a gaiola de alinhamento de vidro fosco. Use um suporte de espelho cinemático e um espelho suspenso para alinhar o feixe de alinhamento ao caminho do feixe de excitação. Use o medidor de energia para maximizar o sinal do feixe de alinhamento após o orifício, ajustando finamente os dois espelhos. Certifique-se de que o feixe permaneça centralizado na gaiola de alinhamento de vidro fosco. Remova a gaiola de alinhamento e reinsira O1. Coloque o espelho quadrado no estágio de amostra de O1 e ajuste o espelho axialmente até que o tamanho do perfil do feixe seja minimizado após o dicroico. Monte uma íris no caminho de emissão e volte o suficiente para que a Lente de Varredura 2 (SL2), a Lente de Tubo 2 (TL2) e a Objetiva 2 (O2) possam ser inseridas sem interferência. Alinhe essa íris ao laser de alinhamento. Monte um disco de vidro fosco pelo menos 1 atrás da íris e certifique-se de que este também esteja alinhado à luz laser. Insira SL2 na distância correta, medida a partir do galvo com uma régua. Ajuste a inclinação e a posição lateral do SL2 de modo que o feixe de alinhamento de entrada esteja centrado no SL2 e o feixe de saída passe através da íris e do disco de vidro fosco. Insira TL2 na distância correta, medida a partir de SL2 com uma régua. Ajuste a inclinação e a posição lateral do TL2 de modo que o feixe de alinhamento de entrada fique centrado no TL2 e o feixe de saída passe através da íris e do disco de vidro fosco. Monte TS2 na mesa. Certifique-se de que o estágio se traduza ao longo do eixo óptico de O2. Rosqueie o O2 em um suporte de tradução xy. Conecte um poste sob o suporte xy para montar o O2 no palco de tradução. Use um alvo de parafuso para centralizar a parte de trás do O2 no laser vermelho. Ajuste os botões xy e a inclinação do O2 para que o feixe de alinhamento vermelho passe através da íris e do disco de vidro fosco. Mova o laser de alinhamento para acima de O1 e direcione para baixo no caminho de emissão. Ligue o laser e certifique-se de que esse feixe esteja centralizado em todas as lentes no caminho de emissão. Conjugar os planos pupilares de O1 e O2 abrindo a íris e removendo o disco de vidro fosco de modo que o feixe de alinhamento que sai de O2 continue desobstruído até uma superfície ou parede distante (>0,5 m) (Figura 4). Ajuste o TS2 até que o feixe forme um pequeno disco Airy na superfície e, em seguida, continue ajustando o TS2 para minimizar o tamanho do disco Airy.NOTA: Um feixe fortemente divergente indica o posicionamento incorreto de O2. No entanto, como esse feixe passa por dois objetivos, uma pequena quantidade de divergência é inerente. Como tal, o disco Airy é o melhor guia. Otimize o galvo para varredura invariante de inclinação: Pressione o botão FSK no gerador de forma de onda para selecionar um sinal de onda triangular para o galvo, e defina para uma frequência baixa (~1 Hz). Observe o feixe de alinhamento na mesma superfície ou parede distante.NOTA: Se o galvo for colocado incorretamente, o feixe varrerá horizontalmente na superfície junto com o movimento do galvo. Isso pode ser resolvido através de ajustes finos (manualmente) da inclinação e posição xy da base do galvo até que o deslocamento do feixe seja indetectável a olho. Verifique a qualidade do sistema por imagem a 0°.Rosqueie o O3 em um suporte de tradução xy. Rosqueie um tubo de lente de 1 no estágio de translação da gaiola e rosqueie o estágio de translação xy no tubo. Use duas hastes de gaiola para conectar a frente do estágio de translação da gaiola a uma placa de gaiola e monte a placa da gaiola em um poste. Monte a Objetiva 3 (O3) perto da frente de O2 (~4-5 mm) a 0° e ajuste a altura para corresponder. Monte um disco de alinhamento de vidro fosco no plano focal compartilhado entre SL2 e TL2, conforme medido com uma régua. Monte a lâmina de teste fluorescente acrílica no palco e ilumine a lâmina com o laser de excitação. Olhe através da parte de trás do O3, ajuste a altura e a posição axial do O3 para encontrar a luz de emissão e, em seguida, ajuste o O3 axialmente até que a luz de emissão preencha a abertura traseira (Figura 5). Rosqueie duas hastes de gaiola 8 na parte de trás do estágio de translação de O3. Deslize uma placa de gaiola com um disco de vidro fosco montado nas hastes e, em seguida, ajuste finamente o O3 usando o suporte xy para garantir que a luz de emissão saia do O3 centralizada. Em seguida, remova as hastes da gaiola. Monte um disco de vidro fosco na posição áspera do sensor da câmera e alinhe a altura e a posição do disco à luz de emissão. Parafuse a lente de tubo 3 (TL3) em uma placa de gaiola e monte-a imediatamente atrás de O3. Centralize o TL3 na luz de emissão de entrada e, em seguida, ajuste a inclinação do TL3 para alinhar a luz de saída ao disco de vidro fosco. Monte a câmera na distância correta da lente do tubo, medida com uma régua. Rosqueie os tubos da lente 2 e o filtro de emissão na câmera. Remonte o disco de alinhamento de vidro fosco no plano focal compartilhado entre SL2 e TL2. Monte a amostra de teste de corante fluorescente e ilumine a amostra com o feixe de excitação. Ligue a câmera e abra o programa Micromanager no computador conectado. Clique em Ao vivo para entrar na visualização ao vivo. Clique em Auto Once para definir as configurações de exposição inicial e, em seguida, redefina a exposição conforme necessário durante a geração de imagens.NOTA: O Micromanager não funcionará correctamente, a menos que seja aberto depois de a câmara ter sido ligada. Ajuste os botões de translação xy no suporte O3 até que o pequeno orifício no disco de alinhamento de vidro esteja centralizado no campo de visão (FoV). Ajustar o O3 axialmente com o estágio de translação da gaiola até que o orifício esteja em foco; as bordas devem aparecer nítidas (Figura 6). Imagem de esferas fluorescentes para verificar a qualidade do sistema. Remova o disco de alinhamento de vidro fosco, monte a amostra de esferas 3D e ilumine a amostra com o feixe de excitação. Ajustar a altura da amostra em relação ao O1 até que as esferas fluorescentes preencham uma região circular no centro da FoV. Ajuste fino da posição do O3 usando o estágio xy e o estágio de translação axial até que as funções de dispersão pontual (PSFs) sejam redondas (indicativas de aberrações mínimas) e brilhantes (indicativas de uma boa relação sinal-ruído) (Figura 7). Se isso não puder ser alcançado ajustando o O3, é altamente provável que o sistema óptico entre os componentes O1 e O2 esteja sub-idealmente alinhado; Siga as verificações de diagnóstico na etapa 3.13 abaixo. Se for possível obter PSFs redondas , pule a etapa de diagnóstico e passe para a inclinação do sistema de imagem. Execute verificações de diagnóstico, se necessário.NOTA: Uma vez que boas PSFs são obtidas, o resto das etapas de diagnóstico podem ser ignoradas.Monte a luz de campo brilhante (BF) acima de O1. Monte o alvo de teste de grade positivo no estágio de amostra na mesma altura axial que o espelho de alinhamento. Centralize a grade de 10 μm e ilumine a grade com a luz BF. Crie imagens da grade na câmera e traduza a amostra até que a grade esteja em foco. Use a imagem de grade para confirmar que o campo no FoV é plano: se não, a grade aparecerá distorcida e curvada. Para corrigir uma imagem de grade incorreta, ajuste a posição xyz e a inclinação de O3 e, em seguida, ajuste o TL3 e a câmera de acordo.Observação : se uma grade plana pode ser alcançada, repita a etapa 3.12.10 e, em seguida, passe para inclinar o sistema de imagem. Configure a câmera de alinhamento ou a câmera de imagem na distância correta para que o SL2 concentre a imagem no sensor. Imagine o alvo da grade no plano intermediário (Figura 8). Se essa grade também estiver enviesada, é altamente provável que o sistema óptico entre os componentes O1 e SL2 esteja sub-idealmente alinhado e deva ser revisitado. Otimize o alinhamento conforme necessário antes de progredir.NOTA: Se a câmera não se encaixar entre SL2 e TL2, use um espelho extra para devolver a imagem 90° após SL2 e para a câmera. Verifique as PSFs no plano intermediário: Depois de verificar a grade, outra boa verificação diagnóstica é verificar as PSFs no mesmo plano intermediário. Uma boa imagem nesse plano, semelhante à Figura 7 , mas com aumento diferente (Figura 9), indica bom alinhamento através do CB2.Observação : se uma grade plana e PSFs redondas podem ser obtidas no plano intermediário, repita a etapa 3.13.2, em seguida, a etapa 3.12.10 e, em seguida, passe para inclinar o sistema de imagem. Incline o subsistema de imagem de O3 para 30°.Remova O3, TL3 e a câmera. Reinsira o O3 a 30° no eixo óptico do O2 usando as linhas da tabela como guia. Monte um disco de alinhamento de vidro fosco no plano focal compartilhado entre SL2 e TL2. Monte a lâmina de teste fluorescente acrílica no palco e ilumine a lâmina com o laser de excitação. Mais uma vez, olhe através da parte de trás do O3, ajuste a altura e a posição axial do O3 para encontrar a luz de emissão a 30° e, em seguida, ajuste o O3 axialmente até que a luz de emissão preencha a abertura traseira. Remova o disco de alinhamento de vidro fosco entre SL2 e TL2 para obter um sinal de emissão mais forte. Rosqueie duas hastes de gaiola 8 na parte de trás do estágio de translação de O3. Deslize uma placa de gaiola com um disco de vidro fosco montado nas hastes e, em seguida, ajuste finamente o O3 usando o suporte xy para garantir que a luz de emissão saia do O3 centralizada. Em seguida, remova as hastes da gaiola. Monte um disco de vidro fosco na posição áspera do sensor da câmera e alinhe a altura e a posição do disco à luz de emissão. Monte TL3 imediatamente atrás do O3. Centralize o TL3 na luz de emissão de entrada e, em seguida, ajuste a inclinação do TL3 para alinhar a luz de saída ao disco de vidro fosco. Para definir com mais precisão a distância da câmera TL3, desaparafuse cuidadosamente o O3 e monte o laser de alinhamento para que ele seja focado pelo TL3 na câmera. Use filtros ND conforme necessário para que a intensidade do laser seja de <1 mW. Inicie a visualização ao vivo da câmera e ajuste o TL3 axialmente para minimizar o ponto laser na câmera. Remonte o disco de alinhamento de vidro fosco no plano focal compartilhado entre SL2 e TL2. Monte a amostra de teste de corante fluorescente e ilumine a amostra com o feixe de excitação. Ajuste os botões de tradução xy no suporte O3 até que o pequeno orifício no disco de alinhamento de vidro esteja dentro do FoV na câmera. Ajustar o estágio de translação da gaiola para mover o O3 axialmente até que o orifício esteja em foco; Certifique-se de que o buraco pareça semelhante ao que fez a 0°. Remonte o alvo de teste de grade positivo na mesma altura axial e ilumine a grade com a luz BF. Confirme se apenas uma seção vertical está em foco (devido à inclinação de 30°). Mais uma vez, use a imagem de grade para confirmar que o campo em todo o FoV é plano, mesmo quando fora de foco. Quando o slide for traduzido axialmente, confirme se a parte em foco do FoV (destino da grade) varre a tela horizontalmente, enquanto os quadrados da grade mantêm um tamanho consistente (Figura 10).Observação : devido à inclinação do plano de imagem na amostra, a grade pode aparecer ligeiramente esticada no plano x. Figura 4: Técnica de laser-in-laser-out. Enviar um feixe de teste colimado através da frente de O1 e observar o feixe que sai de O2 em uma superfície distante. Se todos os componentes estiverem alinhados na distância correta, o feixe formará um pequeno disco Airy na superfície distante. Todas as abreviaturas são as mesmas da Figura 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: Utilização de luz de emissão para alinhamento. (A) Luz de emissão de uma lâmina fluorescente de acrílico sobre um alvo rosqueado atrás do PBF de O2. (B) Encontrar a luz de emissão pela visão através da parte de trás do O3. Abreviações: O2-O3 = objetivos; PGC = plano focal posterior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: Imagem na câmera do disco de alinhamento de vidro fosco focalizado corretamente. O disco foi posicionado no plano intermediário entre o CP2 e o TL2. Barra de escala = 50 μm. Abreviações: SL2 = lente de varredura; TL2 = lente tubular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 7: Imagem da câmera da amostra de contas 3D. A imagem mostra contas de 1 nm com o módulo de imagem ajustado para 0° e iluminado por um feixe circular antes da inserção das lentes cilíndricas. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 8: Alvo de teste de grade positivo corretamente focado no plano intermediário entre SL2 e TL2. As grades planas ao longo de todo o campo indicam bom alinhamento dos componentes SL2 e anterior. Barra de escala = 30 μm. Abreviações: SL2 = lente de varredura; TL2 = lente tubular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 9: Imagem da câmera da amostra de contas 3D. A imagem mostra contas de 1 nm corretamente focadas no plano intermediário entre SL2 e TL2. Barra de escala = 30 μm. Abreviações: SL2 = lente de varredura; TL2 = lente tubular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 10: Alvo de teste de grade positivo com um quadrado amarelo de tamanho consistente sobreposto para corresponder aos quadrados da grade. (A) Grade em foco no lado esquerdo. (B) Grade em foco no lado direito. O quadrado amarelo corresponde ao tamanho das caixas de grade em ambos os lados do FoV. Barras de escala = 30 μm. Abreviação = FoV = campo de visão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 4. Alinhamento da folha de luz oblíqua Remova o O1 e insira novamente a gaiola de alinhamento de vidro fosco duplo em seu lugar. Confirme se o feixe está colimado e centrado em ambos os discos de vidro fosco. Parafuso da lente cilíndrica 1 (CL1) em um suporte de lente rotativa. Monte CL1 no caminho óptico e gire o suporte para que o feixe seja expandido na direção vertical para a mesa óptica. Ajuste a inclinação e a posição lateral do CL1 de modo que o feixe fique centralizado na frente e mantenha uma posição centralizada em ambos os discos de vidro fosco. Parafuse a lente cilíndrica 2 (CL2) em uma montagem de lente giratória e monte CL2 no caminho óptico na distância correta para formar um sistema 4f com CL1. Gire CL2 para a mesma orientação que CL1 para que o feixe seja esticado na direção vertical para a mesa óptica e colimado. Use um cartão de teste para medir a altura do perfil cilíndrico do feixe em vários locais para garantir que o feixe seja colimado. Ajustar a inclinação e a posição lateral da CL2, conforme realizado no passo 4.2. Parafuse a lente cilíndrica 3 (CL3) em uma montagem de lente giratória e monte CL3 no caminho óptico na distância correta para formar um sistema 4f com L3. Gire CL3 para a mesma orientação que CL1 e CL2 para que o feixe seja focalizado até um perfil de folha horizontal no plano focal. Ajustar a inclinação e a posição lateral da CL3, conforme realizado no passo 4.2. Insira a fenda: Usando quatro hastes de gaiola 4 e o suporte de gaiola CL3, monte a fenda em uma orientação vertical no plano focal entre CL3 e L3, conforme medido com uma régua. Use o perfil do feixe de excitação esticado para ajustar a altura e a posição lateral da fenda até que ela fique centralizada na viga. Reinsira O1, monte a amostra de teste de corante fluorescente e ilumine a amostra com a folha de luz de excitação. No sensor da câmera, confirme se a folha de luz de 0° aparece como uma folha vertical fina (Figura 11A). Remova a amostra de teste de corante fluorescente e limpe o O1. Deixe a folha clara expandir-se acima de O1 desobstruída. Usando o controle de estágio de translação motorizado, traduza M1 em direção às lentes cilíndricas para ajustar o ângulo da folha de luz para aproximadamente 60° em relação ao eixo óptico de O1.NOTA: É crucial que a folha de luz esteja inclinada na direção correta para se alinhar com o plano de imagem igualmente inclinado (Figura 12); Se um sistema é disposto de forma diferente deste projeto específico, a direção correta da inclinação pode ser descoberta através do traçado geométrico de raios.NOTA: Para referência, a tradução do M1 2.647 mm em direção à fenda define a folha de luz para a inclinação correta nesta configuração. Reinsira a amostra de teste de corante fluorescente para obter imagens da folha inclinada. Certifique-se de que a folha de luz tenha mantido uma forma de feixe vertical na câmera, mas seja mais larga e mais fraca (Figura 11B). Traduza a amostra axialmente com o estágio para que o corante fluorescente seja iluminado pela folha de luz em cinco profundidades diferentes entre o centro do FoV e o lado direito da tela. Salve cada imagem. Abra as imagens em Fiji. Para cada imagem, selecione a ferramenta Linha e desenhe uma linha horizontal do centro do FoV até o centro da folha de luz. Para medir o deslocamento, acesse Analisar | Meça para ver o comprimento das linhas. Em seguida, plote o deslocamento da folha de luz em função da profundidade da amostra para calcular o ângulo da folha de luz acima de O1. Traduza M1 ligeiramente. Repita as etapas 4.9 e 4.10 até que o ângulo da folha de luz esteja a 60° do eixo óptico de O1, correspondendo ao ângulo do plano da imagem. Figura 11: Imagens da câmera da amostra de teste de corante fluorescente iluminada por uma folha de luz de forma correta. (A) A folha a 90°, reta ao longo do eixo óptico de O1, e (B) inclinada a 30° (60° em relação ao eixo óptico de O1). Barras de escala = 50 μm. Abreviação: O1 = objetivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 12: Direção correta da inclinação da folha de luz para alinhar com o plano de imagem de O1. Abreviação: O1-O3 = objetivos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 5. Ajuste fino do sistema de geração de imagens e coleta de dados Monte o slide de contas 3D e traduza a amostra axialmente com o palco até que as contas preencham o FoV na câmera. Ajustar o O3 utilizando o estágio xy e o estágio de translação do cage, visando minimizar aberrações e otimizar a relação sinal-ruído na imagem (Figura 13). Ajuste do colar de correção de O1, visando minimizar aberrações e otimizar a relação sinal-ruído na imagem. Figura 13: Imagens da câmera da amostra de contas 3D (contas de 1 μm) iluminadas por uma folha de luz de forma correta. (A) Folha a 90°, em linha reta ao longo do eixo óptico de O1, e (B) inclinada a 30° em relação ao eixo óptico de O1. A caixa amarela indica a porção do FoV que é plana, consistente e utilizável (80 μm x 80 μm) e na qual dados confiáveis podem ser capturados. Barras de escala = 50 μm. Abreviações: O1 = objetivo; FoV = campo de visão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 6. Calibrando a ampliação do sistema Monte o alvo de teste de grade positivo no estágio de amostra e ilumine com a luz de campo brilhante. Traduza o slide de grade axialmente com o palco para colocar o slide de grade em foco. Coloque o centro da grade em foco. Capture e salve a imagem e abra-a em Fiji. Use a ferramenta Linha e a função Medir em Fiji para medir com precisão a distância entre duas linhas de grade em pixels. Divida este valor pela distância conhecida (10 μm), para determinar a calibração pixel-a-mícron. Calcule a ampliação (M) do sistema usando o tamanho medido do pixel e o tamanho conhecido de um pixel com a equação (1).(1º) 7. Aquisição de varreduras volumétricas Posicione a amostra.Ligue a visualização da câmera, o galvo, o gerador de funções, a fonte de alimentação, o palco e o laser de excitação. Monte o exemplo e, em seguida, clique no botão FSK no gerador de função para definir uma onda triangular. Para encontrar a amostra, use o gerador de funções para definir o seguinte: amplitude pico-a-pico de 400 mV (usando o botão Ampl. ), 0 deslocamento (usando o botão Offset ) e frequência de 200 mHz. Use a janela Micromanager para definir um tempo de exposição de 100 ms. Role em z manualmente até que o plano de amostra seja atingido. Otimize a configuração z para que a região desejada para a varredura volumétrica passe pela tela durante um ciclo. Selecione os parâmetros de varredura.Certifique-se de que a amplitude de pico a pico esteja definida corretamente, verificando visualmente se a visualização parece estar em foco durante a varredura. Se a qualidade da imagem se degradar mais cedo aproximando-se de uma extremidade da varredura do que da outra, edite o deslocamento no gerador de funções para mover o centro da varredura em direção à melhor região. No programa Micromanager, selecione um tempo de exposição e clique em Multi-D Acq. Use a caixa Contagem para escolher o número de quadros, que definirá o tempo total de aquisição. O intervalo entre quadros (taxa de quadros) será definido pelo tempo de exposição, a menos que um intervalo maior seja especificado na caixa Intervalo. No gerador de funções, defina a frequência para criar uma varredura de volume completo pela metade do período da função de onda triangular (varredura linear em uma direção).Observação : se a taxa de quadros e a frequência forem muito baixas, poucos quadros serão adquiridos para uma varredura de volume e o número de quadros baixo criará artefatos visíveis no pós-processamento. Para referência, a Figura 13 foi composta por ~100 quadros na varredura, e a Figura 14 foi composta por ~800. Também é fundamental considerar a própria amostra ao selecionar os parâmetros. Certifique-se de que o tempo de exposição está definido de modo a que a amostra esteja suficientemente excitada, mas não saturada. A intensidade do laser de excitação também pode ser ajustada para este fim. Se o usuário estiver adquirindo uma série de varreduras volumétricas para caracterizar um processo de variação de tempo em 3D, certifique-se de que a escala de tempo de digitalização exceda a dinâmica de escala de tempo do sistema. Coleta de vídeos: Adquira um time-lapse que capture pelo menos a duração de uma rampa completa para cima ou para baixo da onda triangular, correspondendo a uma varredura completa do volume. 8. Procedimentos pós-processamento Pilhas de imagens volumétricas DeskewingDeskew o volume digitaliza para converter a pilha de imagens em planos inclinados para uma série de imagens em coordenadas xyz reais.NOTA: Existem muitos guias excelentes sobre pós-processamento de imagens de folhas leves e software de código aberto para realizar o deskewing de varreduras de volume existentes, bem como para executar deskewing e salvar imagens deskewed durante a aquisição24. Para examinar o volume, obtenha os dois parâmetros a seguir: a distância real entre dois quadros em pixels (d) e o ângulo entre o plano do quadro e o plano x-y (θ é definido pelo ângulo da folha de luz oblíqua (neste sistema, 30°). A distância entre os quadros dependerá da óptica de imagem e das configurações de aquisição. Localizando o parâmetro dCalibre a distância entre quadros para cada vez que o sistema for substancialmente realinhado. Realize essa calibração com uma pilha de imagens de contas fluorescentes, pois estas são as mais fáceis de usar para diagnosticar problemas. Adquira uma pilha de imagens e execute o código deskewing usando qualquer palpite inicial para o parâmetro d . Abra a pilha de imagens deskewed no ImageJ e role pela pilha. Se d foi definido substancialmente longe de seu verdadeiro valor, observe que as contas aparecerão artificialmente alongadas em x ou y, e contas individuais parecerão se mover no plano xy à medida que o usuário rola pelos quadros em z (em vez de focar e desfocar a partir do mesmo ponto central). Itere sobre o parâmetro d várias vezes até que esses problemas não sejam mais aparentes. Quando o parâmetro d parecer estar razoavelmente próximo do valor verdadeiro, calcule as projeções de intensidade máxima da pilha de imagens ao longo das direções x e y. Note que contas de um diâmetro próximo ao limite de difração podem aparecer alongadas em z, mas idealmente não devem parecer cônicas ou alongadas diagonalmente. Ajuste os parâmetros do deskewing até que esses critérios não melhorem substancialmente com novas iterações. Para referência, os dados mostrados na Figura 13 foram analisados em d = 2,50 pixels, e os dados na Figura 14 foram redigidos em d = 1,0 pixels.NOTA: A distância entre quadros dependerá linearmente da amplitude de varredura, frequência e taxa de quadros.