Här presenterar vi ett detaljerat visuellt protokoll för att utföra modellen för vänster förmaksligering (LAL) i fågelembryot. LAL-modellen förändrar det intrakardiella flödet, vilket förändrar väggskjuvspänningsbelastningen, vilket efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom. Ett tillvägagångssätt för att övervinna utmaningarna med denna svåra mikrokirurgiska modell presenteras.
På grund av dess fyrkammarformade mogna ventrikulära konfiguration, enkla odling, avbildningsåtkomst och effektivitet är fågelembryot en föredragen ryggradsdjurmodell för att studera kardiovaskulär utveckling. Studier som syftar till att förstå den normala utvecklingen och prognosen för medfödda hjärtfel använder i stor utsträckning denna modell. Mikroskopiska kirurgiska tekniker introduceras för att ändra de normala mekaniska belastningsmönstren vid en specifik embryonal tidpunkt och spåra den molekylära och genetiska kaskaden nedströms. De vanligaste mekaniska ingreppen är vänster vitellinvenligering, conotruncal banding och vänster förmaksligering (LAL), som modulerar det intramurala kärltrycket och väggskjuvspänningen på grund av blodflödet. LAL, särskilt om det utförs i ovo, är det mest utmanande ingreppet, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina sekventiella mikrokirurgiska operationerna. Trots sin höga risk är LAL i ovo mycket värdefullt vetenskapligt eftersom det efterliknar hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS) patogenes. HLHS är en kliniskt relevant, komplex medfödd hjärtsjukdom som observeras hos nyfödda människor. Ett detaljerat protokoll för in ovo LAL dokumenteras i detta dokument. I korthet inkuberades befruktade fågelembryon vid 37,5 °C och 60 % konstant luftfuktighet tills de nådde Hamburger-Hamilton (HH) stadierna 20 till 21. Äggskalen sprack upp och de yttre och inre hinnorna togs bort. Embryot roterades försiktigt för att exponera den vänstra förmaksbulben i det gemensamma förmaket. Förmonterade mikroknutar från 10-0 nylonsuturer placerades försiktigt och knöts runt den vänstra förmaksknoppen. Slutligen återställdes embryot till sin ursprungliga position och LAL fullbordades. Normala och LAL-instrumenterade ventriklar visade statistiskt signifikanta skillnader i vävnadspackning. En effektiv LAL-modellgenereringspipeline skulle bidra till studier som fokuserar på synkroniserad mekanisk och genetisk manipulation under den embryonala utvecklingen av kardiovaskulära komponenter. På samma sätt kommer denna modell att utgöra en störd cellkälla för vävnadsodlingsforskning och vaskulär biologi.
Medfödda hjärtfel är strukturella störningar som uppstår på grund av onormal embryonal utveckling1. Förutom genetiska förhållanden påverkas patogenesen av förändrad mekanisk belastning 2,3. Hypoplastiskt vänsterhjärtsyndrom (HLHS), en medfödd hjärtsjukdom, resulterar i en underutvecklad kammare/aorta vid födseln4 med hög dödlighet 5,6. Trots de senaste framstegen i den kliniska hanteringen är den vaskulära tillväxt- och utvecklingsdynamiken för HLHS fortfarande oklar7. Vid normal embryonal utveckling härstammar endokardiet och hjärtmuskeln i vänster kammare (LV) från hjärtats stamceller när den tidiga embryonala hjärtrörsbildningen fortskrider. Den gradvisa förekomsten av myokardtrabekulation, förtjockningsskikt och kardiomyocytproliferation har rapporterats2. För HLHS observeras förändrad trabekulär remodellering och vänsterkammartillplattning, vilket ytterligare bidrar till myokardhypoplasi på grund av onormal kardiomyocytmigration 2,8,9,10
Bland de allmänt använda modellorganismerna för att studera hjärtats utveckling och förstå hemodynamiska förhållanden 11 är fågelembryot att föredra på grund av dess mogna hjärta med fyra kammare och dess lätthet att odla11,12,13,14. Å andra sidan ger avancerad avbildningsåtkomst av zebrafiskembryon och transgena/knockout-möss tydliga fördelar11,12. Olika mekaniska ingrepp har testats för fågelembryot som förändrar det intramurala trycket och väggskjuvspänningen vid utveckling av kardiovaskulära komponenter. Dessa modeller inkluderar vänster vitellinligering, conotruncal banding15 och vänster förmaksligering (LAL)11,12,16. Den resulterande fenotypen på grund av den förändrade mekaniska belastningen kan observeras cirka 24-48 timmar efter det kirurgiska ingreppet i studier med fokus på tidig prognos11,13. LAL-interventionen är en populär teknik för att minska den funktionella volymen i vänster förmak (LA) genom att placera en suturslinga runt den atrioventrikulära öppningen. På samma sätt har mikrokirurgiska ingrepp också utförts som riktar sig mot höger förmaksligering (RAL)17,18. På samma sätt riktar vissa forskare in sig på det vänstra förmaksbihanget (LAA) med hjälp av mikroklipp för att minska volymen på LA19,20. I vissa studier appliceras en kirurgisk nylontråd på den atrioventrikulära knutan19,21. En av de interventioner som används är LAL, som kan efterlikna HLHS men som också är den svåraste modellen att utföra, med mycket små provutbyten på grund av de extremt fina mikrokirurgiska operationer som krävs. I vårt laboratorium utförs LAL i ovo mellan Hamburger-Hamilton (HH) steg 20 och 21, innan det gemensamma förmaket är helt septat 6,14,22,23. En kirurgisk sutur placeras runt LA, vilket förändrar blodflödet i hjärtat. I LAL-modeller av HLHS observeras ökad ventrikelväggsstyvhet, förändrade myofibervinklar och minskad LV-kavitetsstorlek14,24.
I den här videoartikeln finns ett detaljerat protokoll och tillvägagångssätt för in ovo LAL. I korthet inkuberades de befruktade fågelembryona för mikrokirurgi, äggskalet sprack upp och de yttre och inre membranen rensades. Embryot roterades sedan långsamt så att LA var tillgängligt. En 10-0 nylon kirurgisk sutur knöts till förmaksknoppen, och embryot återställdes till sin ursprungliga orientering, vilket fullbordade LAL-proceduren25. LAL och normala ventriklar jämförs för vävnadspackning och kammarvolym via optisk koherenstomografi och grundläggande histologi.
En framgångsrikt genomförd LAL-modellpipeline, som beskrivs här, kommer att bidra till grundläggande studier med fokus på embryonal utveckling av kardiovaskulära komponenter. Denna modell kan också användas tillsammans med genetiska manipulationer och avancerade avbildningsmodaliteter. På samma sätt är den akuta LAL-modellen en stabil källa till sjuka kärlceller för vävnadsodlingsexperiment.
Vid HLHS förändras blodflödet på grund av strukturella defekter, vilket leder till onormal morfologi på vänster sida 4,6. Den nuvarande modellen ger ett praktiskt experimentellt system för att bättre förstå utvecklingen av HLHS och kan till och med efterlikna dess patogenes8. Att etablera en fullt kliniskt likvärdig HLHS-djurmodell är dock en utmanande uppgift. Förutom den aviära LAL-modellen som presenteras här har nya stud…
The authors have nothing to disclose.
Vi uppmärksammar Tubitak 2247A lead researcher award 120C139 som tillhandahåller finansiering. Författarna vill också tacka PakTavuk Gıda. A. S., Istanbul, Turkiet, för tillhandahållande av fertila ägg och stöd till kardiovaskulär forskning.
10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |