Summary

초기 혈관 발달 중 변경된 혈류역학적 하중에 대한 모델로서의 조류 배아의 좌심방 결찰

Published: June 16, 2023
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Summary

여기에서는 조류 배아에서 좌심방 결찰(LAL) 모델을 실행하기 위한 자세한 시각적 프로토콜을 제시합니다. LAL 모델은 벽 전단 응력 하중을 변화시키는 심장 내 흐름을 변경하여 저형성 좌심 증후군을 모방합니다. 이 어려운 미세 수술 모델의 문제를 극복하기 위한 접근 방식이 제시됩니다.

Abstract

4개의 방이 있는 성숙한 심실 구성, 배양 용이성, 이미징 접근 및 효율성으로 인해 조류 배아는 심혈관 발달을 연구하는 데 선호되는 척추동물 모델입니다. 정상적인 발달과 선천성 심장 결함의 예후를 이해하기 위한 연구에서 이 모델을 널리 채택하고 있습니다. 현미경 수술 기법을 도입하여 특정 배아 시점에서 정상적인 기계적 부하 패턴을 변경하고 다운스트림 분자 및 유전 캐스케이드를 추적합니다. 가장 일반적인 기계적 중재는 좌측 vitelline 정맥 결찰, conotruncal banding 및 좌심방 결찰(LAL)로, 혈류로 인한 벽내 혈관 압력과 벽 전단 응력을 조절합니다. 특히 난소에서 수행되는 경우 LAL은 매우 미세한 순차 미세 수술 수술로 인해 샘플 수율이 매우 작기 때문에 가장 어려운 중재입니다. 높은 위험성에도 불구하고 난자에서 LAL은 저형성 좌심 증후군(HLHS) 발병 기전을 모방하기 때문에 과학적으로 매우 가치가 있습니다. HLHS는 인간 신생아에서 관찰되는 임상적으로 관련된 복잡한 선천성 심장 질환입니다. in ovo LAL에 대한 자세한 프로토콜은 이 문서에 설명되어 있습니다. 간략하게, 수정된 조류 배아는 햄버거-해밀턴(HH) 단계 20 내지 21단계에 도달할 때까지 전형적으로 37.5°C 및 60% 일정한 습도에서 배양하였다. 달걀 껍질을 깨뜨리고 외막과 내막을 제거했습니다. 배아를 부드럽게 회전시켜 총심방의 좌심구를 노출시켰다. 10-0 나일론 봉합사로 사전 조립된 마이크로 매듭을 부드럽게 배치하고 왼쪽 심방 새싹 주위에 묶었습니다. 마침내, 배아를 원래 위치로 되돌려 놓았고, LAL이 완성되었다. 정상 심실과 LAL 기구 심실은 조직 압축에서 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 효율적인 LAL 모델 생성 파이프라인은 심혈관 구성 요소의 배아 발달 중 동기화된 기계적 및 유전적 조작에 초점을 맞춘 연구에 기여할 것입니다. 마찬가지로, 이 모델은 조직 배양 연구 및 혈관 생물학을 위한 교란된 세포 소스를 제공할 것입니다.

Introduction

선천성 심장 결손(CHD)은 비정상적인 배아 발달로 인해 발생하는 구조적 장애입니다1. 유전적 조건 외에도 발병 기전은 변경된 기계적 부하에 의해 영향을 받습니다 2,3. 선천성 심장 질환인 저형성 좌심 증후군(HLHS)은 출생 시 심실/대동맥이 제대로 발달하지 않아 4 사망률이 높다 5,6. 최근 임상 관리의 발전에도 불구하고 HLHS의 혈관 성장 및 발달 역학은 여전히 불분명하다7. 정상적인 배아 발달에서 좌심실(LV) 심내막과 심근은 초기 배아 심관 형성이 진행됨에 따라 심장 전구 세포에서 비롯됩니다. 심근 섬유주, 두꺼워지는 층 및 심근 세포 증식의 점진적인 존재가 보고된다2. HLHS의 경우, 섬유주 리모델링의 변화와 좌심실 평탄화가 관찰되며, 이는 비정상적인 심근세포 이동으로 인한 심근 형성 부전의 원인이 된다 2,8,9,10

심장 발달을 연구하고 혈류역학적 조건11을 이해하기 위해 널리 사용되는 모델 유기체 중에서, 조류 배아는 4개의 방이 있는 성숙한 심장과 배양의 용이성으로 인해 선호된다11,12,13,14. 반면에, 제브라피시 배아와 형질전환/녹아웃 마우스의 고급 이미징 접근은 뚜렷한 이점을 제공합니다11,12. 심혈관 구성 요소 발달에서 교내 압력과 벽 전단 응력을 변경하는 조류 배아에 대한 다양한 기계적 개입이 테스트되었습니다. 이러한 모델에는 좌측 vitelline 결찰술, conotruncal banding15 및 좌심방 결찰술(left atrial ligation, LAL)11,12,16이 포함된다. 변경된 기계적 부하로 인한 결과 표현형은 초기 예후에 초점을 맞춘 연구에서 외과적 개입 후 약 24-48시간 후에 관찰될 수 있습니다11,13. LAL 중재술은 방실 개구부 주위에 봉합사 루프를 배치하여 좌심방(LA)의 기능적 용적을 좁히는 데 널리 사용되는 기술입니다. 마찬가지로, 우심방 결찰술(RAL)을 표적으로 하는 미세수술적 중재도 수행되었습니다17,18. 유사하게, 일부 연구자들은 LA19,20의 부피를 줄이기 위해 마이크로 클립을 사용하여 좌심방 부속기(LAA)를 표적으로 삼습니다. 일부 연구에서는 수술용 나일론 실이 방실 결절(19,21)에 적용됩니다. 사용된 중재 중 하나는 HLHS를 모방할 수 있지만 매우 미세한 미세 수술 수술이 필요하기 때문에 샘플 수율이 매우 작아 수행하기 가장 어려운 모델이기도 합니다. 우리 실험실에서 LAL은 햄버거-해밀턴(HH) 단계 20과 21 사이에 난형으로 수행되며, 그 후 공통 아트리움이완전히 격막이 6,14,22,23이 됩니다. 수술용 봉합사가 LA 주변에 배치되어 심장 내 혈류를 변경합니다. HLHS의 LAL 모델에서는 심실 벽 강성 증가, 근섬유 각도 변화 및 LV 공동 크기 감소가 관찰됩니다14,24.

이 비디오 문서에서는 in ovo LAL에 대한 자세한 프로토콜 및 접근 방식을 제공합니다. 간단히 말해서, 수정된 조류 배아를 미세 수술을 위해 배양하고, 달걀 껍질을 깨서 열고, 외막과 내막을 제거했습니다. 그런 다음 배아를 천천히 회전시켜 LA에 접근할 수 있도록 했습니다. 10-0 나일론 수술용 봉합사를 심방 봉오리에 묶고, 배아를 원래의 방향으로 되돌려 LAL 절차25를 완료하였다. LAL과 정상 심실은 광간섭 단층 촬영과 기본 조직학 을 통해 조직 압축과 심실 부피를 비교합니다.

여기에 설명된 대로 성공적으로 실행된 LAL 모델 파이프라인은 심혈관 구성 요소의 배아 발달에 초점을 맞춘 기초 연구에 기여할 것입니다. 이 모델은 유전자 조작 및 고급 이미징 양식과 함께 사용할 수도 있습니다. 마찬가지로, 급성 LAL 모델은 조직 배양 실험을 위한 병든 혈관 세포의 안정적인 공급원입니다.

Protocol

유정 백색 레그혼 알은 신뢰할 수 있는 공급업체로부터 얻어 대학에서 승인한 지침에 따라 배양합니다. 병아리 배아, 18단계(3일차)에서 24단계(4일차)(이 논문에 제시된 단계)는 유럽 연합(EU) 지침 2010/63/EU 및 미국의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee) 지침에 따라 살아있는 척추동물로 간주되지 않습니다. 병아리 배아는 미국 법률에 따라 부화 19일 이후 “살아있는 동물”로 간주되지만 EU에서는 ?…

Representative Results

LAL 중재로 인한 구조적 및 형태학적 변화를 관찰하기 위해 고급 시간 분해 이미징 기술을 사용할 수있다 10. 또한, LAL 샘플은 분자 및 생물학적 방법(19,28)에도 적용할 수 있습니다. 표 1에는 LAL 모델 결과를 사용한 샘플 연구가 제공되어 있습니다. 이러한 맥락에서 LAL 중재는 HH20-21에 도달한 병아리 배아에서 수행되었습니다…

Discussion

HLHS에서는 구조적 결함으로 인해 혈류가 변경되어 왼쪽의 비정상적인 형태가 발생합니다 4,6. 본 모델은 HLHS의 진행을 더 잘 이해할 수 있는 실용적인 실험 시스템을 제공하며, 심지어 발병기전을 모방할 수도 있다8. 그러나 임상적으로 완전히 동등한 HLHS 동물 모델을 확립하는 것은 어려운 작업입니다. 여기에 제시된 조류 LAL 모델 외에…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 Tubitak 2247A 선임 연구원 상 120C139가 자금을 제공하는 것을 인정합니다. 저자는 또한 PakTavuk Gıda에게 감사하고 싶습니다. A. S., 터키 이스탄불, 수정란을 제공하고 심혈관 연구를 지원해 준 것.

Materials

10-0 nylon surgical suture Ethicon
Elastica van Gieson staining kit Sigma-Aldrich 115974 For staining connective tissues in histological sections
Ethanol absolute Interlab 64-17-5 For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water.
Incubator KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A AZYSS600-110
Kimwipes Interlab 080.65.002
Microscissors World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 555640S Vannas STR 82 mm
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793-1EA Sealing stage for egg reincubation
Paraplast Bulk Leica Biosystems  39602012 Tissue embedding medium
Stereo Microscope Zeiss Stemi 508  Stemi 508 Used at station 1
Stereo Microscope Zeiss Stemi 2000-C Stemi 2000-C Used at station 2
Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) Adumont & Fils, Switzerland Used to return the embryo
Tweezer (Super Fine Dumont #5SF)  World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL 501985 Used to remove the membranes on the embryo

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Sevgin, B., Coban, M. N., Karatas, F., Pekkan, K. Left Atrial Ligation in the Avian Embryo as a Model for Altered Hemodynamic Loading During Early Vascular Development. J. Vis. Exp. (196), e65330, doi:10.3791/65330 (2023).

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