ربط الأذين الأيسر في جنين الطيور كنموذج لتغير الحمل الديناميكي للدورة الدموية أثناء نمو الأوعية الدموية المبكر
Summary
نقدم هنا بروتوكولا مرئيا مفصلا لتنفيذ نموذج ربط الأذين الأيسر (LAL) في جنين الطيور. يغير نموذج LAL التدفق داخل القلب ، مما يغير تحميل إجهاد قص الجدار ، ويحاكي متلازمة القلب الأيسر ناقص التنسج. يتم تقديم نهج للتغلب على تحديات نموذج الجراحة المجهرية الصعب هذا.
Abstract
نظرا لتكوين البطين الناضج المكون من أربع غرف ، وسهولة المزرعة ، والوصول إلى التصوير ، والكفاءة ، فإن جنين الطيور هو نموذج حيواني مفضل للفقاريات لدراسة تطور القلب والأوعية الدموية. الدراسات التي تهدف إلى فهم التطور الطبيعي وتشخيص عيوب القلب الخلقية تعتمد هذا النموذج على نطاق واسع. يتم إدخال التقنيات الجراحية المجهرية لتغيير أنماط التحميل الميكانيكية الطبيعية في نقطة زمنية جنينية محددة وتتبع الشلال الجزيئي والجيني في اتجاه مجرى النهر. التدخلات الميكانيكية الأكثر شيوعا هي ربط الوريد الأيسر ، وربط conotruncal ، وربط الأذين الأيسر (LAL) ، وتعديل ضغط الأوعية الدموية داخل الفم وإجهاد قص الجدار بسبب تدفق الدم. LAL ، خاصة إذا تم إجراؤه في البويضات ، هو التدخل الأكثر تحديا ، مع إنتاجية عينة صغيرة جدا بسبب العمليات الجراحية المجهرية المتسلسلة الدقيقة للغاية. على الرغم من مخاطره العالية ، إلا أن LAL في البويضات ذو قيمة علمية كبيرة لأنه يحاكي التسبب في متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS). HLHS هو مرض قلبي خلقي معقد ذو صلة سريريا لوحظ عند الأطفال حديثي الولادة. تم توثيق بروتوكول مفصل ل في ovo LAL في هذه الورقة. لفترة وجيزة ، تم تحضين أجنة الطيور المخصبة عند 37.5 درجة مئوية ورطوبة ثابتة بنسبة 60٪ عادة حتى وصلت إلى مراحل هامبرغر هاملتون (HH) من 20 إلى 21. تم تكسير قشر البيض ، وإزالة الأغشية الخارجية والداخلية. تم تدوير الجنين برفق لكشف المصباح الأذيني الأيسر للأذين المشترك. تم وضع العقد الدقيقة المجمعة مسبقا من 10-0 خيوط نايلون برفق وربطها حول برعم الأذين الأيسر. أخيرا ، أعيد الجنين إلى موضعه الأصلي ، وتم الانتهاء من LAL. أظهر البطينان الطبيعيان والبطينان المزودان ب LAL اختلافات ذات دلالة إحصائية في ضغط الأنسجة. سيساهم خط أنابيب توليد نموذج LAL الفعال في الدراسات التي تركز على التلاعب الميكانيكي والجيني المتزامن أثناء التطور الجنيني لمكونات القلب والأوعية الدموية. وبالمثل ، سيوفر هذا النموذج مصدرا للخلايا المضطربة لأبحاث زراعة الأنسجة وبيولوجيا الأوعية الدموية.
Introduction
عيوب القلب الخلقية (CHDs) هي اضطرابات هيكلية تحدث بسبب التطور الجنيني غير الطبيعي1. بالإضافة إلى الظروف الوراثية ، يتأثر التسبب في المرض بالتحميل الميكانيكي المتغير 2,3. تؤدي متلازمة القلب الأيسر الناقص التنسج (HLHS) ، وهو مرض خلقي في القلب ، إلى تخلف البطين / الشريان الأورطي عند الولادة4 مع ارتفاع معدل الوفيات 5,6. على الرغم من التطورات الأخيرة في إدارتها السريرية ، لا تزال ديناميكيات نمو الأوعية الدموية وتطورها في HLHS غير واضحة7. في التطور الجنيني الطبيعي ، ينشأ شغاف البطين الأيسر (LV) وعضلة القلب من أسلاف القلب مع تقدم تكوين أنبوب القلب الجنيني المبكر. تم الإبلاغ عن الوجود التدريجي لترابيق عضلة القلب ، وطبقات سميكة ، وتكاثر عضلة القلب2. بالنسبة ل HLHS ، لوحظ تغيير إعادة تشكيل التربيق وتسطيح البطين الأيسر ، مما يساهم بشكل أكبر في نقص تنسج عضلة القلب بسبب هجرة خلايا عضلة القلب غير الطبيعية2،8،9،10
من بين الكائنات النموذجية المستخدمة على نطاق واسع لدراسة نمو القلب وفهم ظروف الدورة الدموية 11 ، يفضل جنين الطيور بسبب قلبه الناضج المكون من أربع غرف وسهولة استزراعه11،12،13،14. من ناحية أخرى ، يوفر الوصول المتقدم للتصوير لأجنة الزرد والفئران المعدلة وراثيا / بالضربة القاضية مزايا مميزة11,12. تم اختبار التدخلات الميكانيكية المختلفة لجنين الطيور التي تغير الضغط الداخلي وإجهاد قص الجدار في تطوير مكونات القلب والأوعية الدموية. تشمل هذه النماذج ربط vitelline الأيسر ، وربط conotruncal15 ، وربط الأذين الأيسر (LAL) 11،12،16. يمكن ملاحظة النمط الظاهري الناتج بسبب الحمل الميكانيكي المتغير حوالي 24-48 ساعة بعد التدخل الجراحي في الدراسات التي تركز على التشخيص المبكر11,13. يعد تدخل LAL تقنية شائعة لتضييق الحجم الوظيفي للأذين الأيسر (LA) عن طريق وضع حلقة خياطة حول الفتحة الأذينية البطينية. وبالمثل ، تم إجراء التدخلات الجراحية المجهرية التي تستهدف ربط الأذين الأيمن (RAL)17,18. وبالمثل ، يستهدف بعض الباحثين الزائدة الأذينية اليسرى (LAA) باستخدام مقاطع صغيرة لتقليل حجم LA19,20. في بعض الدراسات ، يتم تطبيق خيط نايلون جراحي على العقدة الأذينية البطينية19,21. أحد التدخلات المستخدمة هو LAL ، والذي يمكن أن يحاكي HLHS ولكنه أيضا أصعب نموذج في الأداء ، مع غلة عينة صغيرة جدا بسبب العمليات الجراحية المجهرية الدقيقة للغاية المطلوبة. في مختبرنا ، يتم إجراء LAL في البويضة بين مرحلتي هامبرغر هاميلتون (HH) 20 و 21 ، قبل أن يتم فصل الأذين المشترك بالكامل6،14،22،23. يتم وضع خياطة جراحية حول لوس أنجلوس ، مما يغير تيارات تدفق الدم داخل القلب. في نماذج LAL من HLHS ، لوحظ زيادة تصلب جدار البطين ، وتغيير زوايا الألياف العضلية ، وانخفاض حجم تجويف LV14,24.
في مقالة الفيديو هذه ، يتم توفير بروتوكول ونهج مفصل ل في ovo LAL. لفترة وجيزة ، تم تحضين أجنة الطيور المخصبة لإجراء جراحة مجهرية ، وتم تكسير قشر البيض ، وتم تطهير الأغشية الخارجية والداخلية. ثم تم تدوير الجنين ببطء بحيث يمكن الوصول إلى LA. تم ربط خياطة جراحية من النايلون 10-0 ببرعم الأذين ، وأعيد الجنين إلى اتجاهه الأصلي ، ليكمل إجراء LAL25. تتم مقارنة LAL والبطينين الطبيعيين لضغط الأنسجة وحجم البطين عن طريق التصوير المقطعي للتماسك البصري والأنسجة الأساسية.
سيساهم خط أنابيب نموذج LAL الذي تم تنفيذه بنجاح ، كما هو موضح هنا ، في الدراسات الأساسية التي تركز على التطور الجنيني لمكونات القلب والأوعية الدموية. يمكن أيضا استخدام هذا النموذج مع التلاعب الجيني وطرق التصوير المتقدمة. وبالمثل ، فإن نموذج LAL الحاد هو مصدر مستقر لخلايا الأوعية الدموية المريضة لتجارب زراعة الأنسجة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في HLHS ، يتم تغيير تدفق الدم بسبب العيوب الهيكلية ، مما يؤدي إلى مورفولوجيا غير طبيعية على الجانب الأيسر4،6. يوفر النموذج الحالي نظاما تجريبيا عمليا لفهم تطور HLHS بشكل أفضل وقد يحاكي حتى التسبب فيالمرض 8. ومع ذلك ، فإن إنشاء نموذج حيواني HLHS مكافئ سر…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بجائزة Tubitak 2247A للباحث الرئيسي 120C139 لتوفير التمويل. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا PakTavuk Gıda. أ. س.، اسطنبول، تركيا، لتوفير البويضات الخصبة ودعم أبحاث القلب والأوعية الدموية.
Materials
| 10-0 nylon surgical suture | Ethicon | ||
| Elastica van Gieson staining kit | Sigma-Aldrich | 115974 | For staining connective tissues in histological sections |
| Ethanol absolute | Interlab | 64-17-5 | For the sterilization step, 70% ethanol was obtained by diluting absolute ethanol with distilled water. |
| Incubator | KUHL, Flemington, New Jersey-U.S.A | AZYSS600-110 | |
| Kimwipes | Interlab | 080.65.002 | |
| Microscissors | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 555640S | Vannas STR 82 mm |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | Sealing stage for egg reincubation |
| Paraplast Bulk | Leica Biosystems | 39602012 | Tissue embedding medium |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 508 | Stemi 508 | Used at station 1 |
| Stereo Microscope | Zeiss Stemi 2000-C | Stemi 2000-C | Used at station 2 |
| Tweezer (Dumont 4 INOX #F4) | Adumont & Fils, Switzerland | Used to return the embryo | |
| Tweezer (Super Fine Dumont #5SF) | World Precision Instruments (WPI), Sarasota FL | 501985 | Used to remove the membranes on the embryo |
Referências
- Wang, T., et al. Congenital heart disease and risk of cardiovascular disease: A meta-analysis of cohort studies. Journal of the American Heart Association. 8 (10), e012030 (2019).
- Chaudhry, B., et al. The left ventricular myocardium in hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (8), 279 (2022).
- Lashkarinia, S. S., Çoban, G., Ermek, E., Çelik, M., Pekkan, K. Spatiotemporal remodeling of embryonic aortic arch: stress distribution, microstructure, and vascular growth in silico. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 19 (5), 1897-1915 (2020).
- Ho, S., Chan, W. X., Yap, C. H. Fluid mechanics of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (4), 1337-1351 (2021).
- Gordon, B. M., Rodriguez, S., Lee, M., Chang, R. K. Decreasing number of deaths of infants with hypoplastic left heart syndrome. The Journal of Pediatrics. 153 (3), 354-358 (2008).
- Salman, H. E., et al. Effect of left atrial ligation-driven altered inflow hemodynamics on embryonic heart development: clues for prenatal progression of hypoplastic left heart syndrome. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 20 (2), 733-750 (2021).
- Fruitman, D. S. Hypoplastic left heart syndrome: Prognosis and management options. Paediatrics & Child Health. 5 (4), 219-225 (2000).
- Rahman, A., Chaturvedi, R. R., Sled, J. G. Flow-mediated factors in the pathogenesis of hypoplastic left heart syndrome. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (5), 154 (2022).
- Henderson, D. J., Anderson, R. H. The development and structure of the ventricles in the human heart. Pediatric Cardiology. 30 (5), 588-596 (2009).
- Kowalski, W. J., Pekkan, K., Tinney, J. P., Keller, B. B. Investigating developmental cardiovascular biomechanics and the origins of congenital heart defects. Frontiers in Physiology. 5, 408 (2014).
- Midgett, M., Rugonyi, S. Congenital heart malformations induced by hemodynamic altering surgical interventions. Frontiers in Physiology. 5, 287 (2014).
- Kowalski, W. J., et al. Left atrial ligation alters intracardiac flow patterns and the biomechanical landscape in the chick embryo. Developmental Dynamics. 243 (5), 652-662 (2014).
- Bruneau, B. G. The developmental genetics of congenital heart disease. Nature. 451 (7181), 943-948 (2008).
- Sedmera, D., et al. Cellular changes in experimental left heart hypoplasia. The Anatomical Record. 267 (2), 137-145 (2002).
- Celik, M., et al. Microstructure of early embryonic aortic arch and its reversibility following mechanically altered hemodynamic load release. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), H1208-H1218 (2020).
- Tobita, K., Schroder, E. A., Tinney, J. P., Garrison, J. B., Keller, B. B. Regional passive ventricular stress-strain relations during development of altered loads in chick embryo. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 282 (6), H2386-H2396 (2002).
- Alser, M., Shurbaji, S., Yalcin, H. C. Mechanosensitive pathways in heart development: findings from chick embryo studies. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 8 (4), 32 (2021).
- Alser, M., et al. Blood flow disturbance and morphological alterations following the right atrial ligation in the chick embryo. Frontiers in Physiology. 13, 849603 (2022).
- Sedmera, D. HLHS: Power of the chick model. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (4), 113 (2022).
- Rychter, Z., Rychterová, V., Lemez, L. Formation of the heart loop and proliferation structure of its wall as a base for ventricular septation. Herz. 4 (2), 86-90 (1979).
- Harh, J. Y., Paul, M. H., Gallen, W. J., Friedberg, D. Z., Kaplan, S. Experimental production of hypoplastic left heart syndrome in the chick embryo. The Americal Journal of Cardiology. 31 (1), 51-56 (1973).
- Sedmera, D., Pexieder, T., Rychterova, V., Hu, N., Clark, E. B. Remodeling of chick embryonic ventricular myoarchitecture under experimentally changed loading conditions. The Anatomical Record. 254 (2), 238-252 (1999).
- Karakaya, C., et al. Asymmetry in mechanosensitive gene expression during aortic arch morphogenesis. Scientific Reports. 8 (1), 16948 (2018).
- Trinidad, F., et al. Effect of blood flow on cardiac morphogenesis and formation of congenital heart defects. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (9), 303 (2022).
- Tobita, K., Keller, B. B. Right and left ventricular wall deformation patterns in normal and left heart hypoplasia chick embryos. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (3), H959-H969 (2000).
- Bortecine, S., Merve Nur, C., Faruk, K., Kerem, P. Auxiliary humidifier system design and construction for research grade egg incubators. Zenodo. , (2023).
- Schroder, E. A., Tobita, K., Tinney, J. P., Foldes, J. K., Keller, B. B. Microtubule involvement in the adaptation to altered mechanical load in developing chick myocardium. Circulation Research. 91 (4), 353-359 (2002).
- Rufaihah, A. J., Chen, C. K., Yap, C. H., Mattar, C. N. Z. Mending a broken heart: In vitro, in vivo and in silico models of congenital heart disease. Disease Models & Mechanisms. 14 (3), (2021).
- Siddiqui, H. B., Dogru, S., Lashkarinia, S. S., Pekkan, K. Soft-tissue material properties and mechanogenetics during cardiovascular development. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (2), 64 (2022).
- Pesevski, Z., et al. Endocardial fibroelastosis is secondary to hemodynamic alterations in the chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Developmental Dynamics. 247 (3), 509-520 (2018).
- Hu, N., et al. Dependence of aortic arch morphogenesis on intracardiac blood flow in the left atrial ligated chick embryo. Anatomical Record. 292 (5), 652-660 (2009).
- Lashkarinia, S. S., et al. Myocardial biomechanics and the consequent differentially expressed genes of the left atrial ligation chick embryonic model of hypoplastic left heart syndrome. Annals of Biomedical Engineering. 51 (5), 1063-1078 (2023).
- Krejčí, E., et al. Microarray analysis of normal and abnormal chick ventricular myocardial development. Physiological Research. 61, S137-S144 (2012).
- Rahman, A., et al. A mouse model of hypoplastic left heart syndrome demonstrating left heart hypoplasia and retrograde aortic arch flow. Disease Models & Mechanisms. 14 (11), (2021).
- Fishman, N. H., Hof, R. B., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Models of congenital heart disease in fetal lambs. Circulation. 58 (2), 354-364 (1978).
- Wong, F. Y., et al. Induction of left ventricular hypoplasia by occluding the foramen ovale in the fetal lamb. Scientific Reports. 10 (1), 880 (2020).
- Nie, S. Use of frogs as a model to study the etiology of HLHS. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 10 (2), 51 (2023).
- Vilches-Moure, J. G. Embryonic chicken (Gallus gallus domesticus) as a model of cardiac biology and development. Comparative Medicine. 69 (3), 184-203 (2019).
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Sukparangsi, W., Thongphakdee, A., Intarapat, S. Avian embryonic culture: A perspective of in ovo to ex ovo and in vitro studies. Frontiers in Physiology. 13, 903491 (2022).
