Método "Brain Milking" para o Isolamento de Células-Tronco Neurais e Células Progenitoras de Oligodendrócitos de Ratos Vivos
Summary
Um método para o isolamento de células-tronco neurais e células progenitoras de oligodendrócitos do cérebro de ratos vivos é apresentado aqui em detalhes experimentais. Permite múltiplas coletas dessas células dos mesmos animais sem comprometer seu bem-estar.
Abstract
As células-tronco neurais tecido-específicas (NSCs) permanecem ativas no cérebro pós-natal de mamíferos. Residem em nichos especializados, onde geram novos neurônios e glia. Um desses nichos é a zona subependimária (ZEE, também chamada de zona ventricular-subventricular), que está localizada através das paredes laterais dos ventrículos laterais, adjacente à camada de células ependimárias. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) distribuem-se abundantemente pelo sistema nervoso central, constituindo um pool de células progenitoras proliferativas que podem gerar oligodendrócitos.
Tanto NSCs quanto OPCs exibem potencial de auto-renovação e ciclos de quiescência/ativação. Devido à sua localização, o isolamento e a investigação experimental dessas células são realizados post-mortem. Aqui, descrevemos em detalhes a “ordenha cerebral”, um método para o isolamento de NSCs e OPCs, entre outras células, de animais vivos. Este é um protocolo de duas etapas projetado para uso em roedores e testado em ratos. Primeiro, as células são “liberadas” do tecido por meio da injeção intracerebroventricular (i.c.v.) estereotáxica de um “coquetel de liberação”. Os principais componentes são a neuraminidase, que tem como alvo as células ependimárias e induz o desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador da integrina-β1 e o fator de crescimento de fibroblastos-2. Em uma segunda etapa de “coleta”, biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano são realizadas a partir da cisterna magna, em ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão.
Os resultados aqui apresentados mostram que as células isoladas mantêm seu perfil endógeno e que as NSCs da ZEE preservam sua quiescência. O desnudamento da camada ependimária é restrito ao nível anatômico de injeção e o protocolo (liberação e coleta) é bem tolerado pelos animais. Esta nova abordagem abre caminho para a realização de estudos longitudinais de neurogênese endógena e gliogênese em animais experimentais.
Introduction
As células-tronco tecido-específicas são células parcialmente comprometidas que podem dar origem a todas as populações celulares que constituem os respectivos tecidos. Além de multipotentes, são células auto-renovadoras e cruciais para a manutenção da homeostase e da capacidade regenerativa dostecidos1. Algumas células-tronco tecido-específicas permanecem em um estado ativo e fortemente proliferativo, como células-tronco intestinais ou hematopoiéticas. Outras, como as células-tronco cerebrais, permanecem em grande parte quiescentes ou dormentes2. No cérebro adulto, as células-tronco neurais (NSCs) podem ser encontradas em áreas especializadas, muitas vezes chamadas de nichos. Duas dessas áreas bem descritas existem na zona subependimária (ZEE) dos ventrículos laterais e no giro denteado do hipocampo. O nicho SEZ gera o maior número de células, principalmente neuroblastos que migram em direção aos bulbos olfativos e contribuem para a população local de interneurônios; em contraste, os oligodendroblastos gerados migram para o corpo caloso adjacente (CC)3. As células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) são células mitoticamente ativas, amplamente distribuídas pelo sistema nervoso central, que: i) estão comprometidas com a linhagem oligodendroglial, ii) podem migrar para sítios de desmielinização e iii) podem se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes. OPCs também apresentam potencial de auto-renovação e quiescência4.
Até agora, o isolamento e o estudo de NSCs e OPCs exigiam a dissociação post-mortem do tecido cerebral e medular dissecado. Para contornar essa limitação experimental, estabelecemos um método que permite, pela primeira vez, o isolamento de NSCs e OPCs cerebrais de animais vivos. Chamamos esse método de “ordenha”, porque ele permite várias coletas de células, pois seus pools não se esgotam. O protocolo foi desenvolvido em ratos, devido ao seu grande tamanho cerebral, visando principalmente a ZEE, ou CC, e inclui duas etapas principais. Primeiro, NSCs ou OPCs são “removidos” do tecido por meio da injeção i.c.v. de um “coquetel de liberação” contendo neuraminidase, uma toxina que induz desnudamento da parede ventricular, um anticorpo bloqueador de integrina-β1 e fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O coquetel é injetado estereotaxicamente bilateralmente dentro dos ventrículos laterais. Se o uso pretendido for o isolamento de NSCs, áreas rostrais dos ventrículos laterais são alvo. Se o objetivo é isolar OPCs mais puramente, o coquetel é injetado caudalmente na área da fímbria hipocampal. Em uma segunda etapa de “coleta”, biópsias líquidas do líquido cefalorraquidiano (LCR) são realizadas a partir da cisterna magna de ratos anestesiados, sem a necessidade de incisão. A biópsia líquida é misturada com meio de cultura NSC e pode ser mantida a 4 °C até o plaqueamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
As células-tronco e progenitoras são relativamente esparsas no tecido cerebral de mamíferos. Além disso, os NSCs estão localizados em áreas inacessíveis para biópsias fáceis e seguras (paredes ventriculares, hipocampo). Portanto, a única maneira de trabalhar experimentalmente com essas células, até agora, tem sido seu isolamento post-mortem. Um método que permite a coleta única ou repetida de NSCs e OPCs de ratos vivos, denominado ordenha, é descrito passo a passo. O método baseia-se em duas característi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa Action Medical Research (UK) (GN2291) para R.J.M.F. e I.K. O trabalho de pesquisa também foi parcialmente apoiado (custos de animais e apoio à D.D.) pela Fundação Helênica para Pesquisa e Inovação (H.F.R.I.) no âmbito da “Primeira Chamada para Projetos de Pesquisa H.F.R.I. para apoiar membros do corpo docente e pesquisadores e a aquisição de bolsa de equipamentos de pesquisa de alto custo” (Número do Projeto: 3395).
Materials
| Release cocktail | |||
| β1-integrin-blocking antibody | BD Biosciences | #555002 | purified NA/LE Hamster Anti-Rat CD29 Clone Ha2/5, 1 mg/mL. Any abntibody with blocking activity should be appropriate. |
| Neuraminidase from Clostridium perfringens (Clostridium welchii) | Sigma-Aldrich | #N2876 | Neuraminidases fromother sources (e.g., from Vibrio cholerae) have not been tested. |
| Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.) | Peprotech | #100-18B | kept as a 1 μg/μL stock, diluted in sterile water at -20 °C |
| Surgical procedures | |||
| 10 µL Syringe | Hamilton | #80330 | Model 701 RN, Small Removable Needle, 26s gauge, 2 in., point style 2 |
| BD Micro-fine 1 mL insulin syringes | BD biosciences | 04085-00 | 29 G x 12.7 mm |
| BETADINE CUT.SOL 10% FLx30ML | LAVIPHARM-CASTALIA | SKU: 5201048131168 | |
| Bupaq | RICHTERPHARMA | 1021854AF | 10 mL (buprenophine 0.3 mg/mL) |
| Digital New Standard Stereotaxic, Rat and Mouse | Stoelting | 51500D | |
| Homeothermic Monitoring System | Harvard Apparatus | 55-7020 | |
| ISOFLURIN 1,000 mg/g inhalation vapour, liquid | Vetpharma Animal Health | 32509/4031 | |
| Ketamidor | RICHTER PHARMA | SKU: 9004114002531 | Ketamine 100 mg/mL |
| Nylon suture, Ethilon | Ethicon | D9635 | Clear , size 5-0 |
| Rechargeable Cordless Surgical Trimmers | Stoelting | Item:51472 | |
| Scalpel blades, sterile | Swann Morton | AW050 | |
| Scopettes Jr. 8-inch Swabs | Birchwood Laboratories | 34-7021-12P | |
| Stereotaxic High Speed Drill | Foredom | 1474w/o1464 | |
| Stoelting’s Stereotaxic Instrument Kit | Stoelting | Item: 52189 | |
| Xylan 2% | Chanelle Pharmaceuticals | 13764/03/19-5-2004 | Xylazine, 25 mL |
| Tissue and cells handling and immunostainings | |||
| 96-well plates appropriate for microscopy | Greiner | #655866 | Screen star microplate |
| B27 supplement | ThermoFisher Scientific | A1486701 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Merck | P06-1391100 | Fraction V, heat shock |
| Citrate | Merck | 71497 | Sodium citrate monobasic |
| Cryostat | Leica | CM1510S | |
| DAPI | Merck, Calbiochem | 28718-90-3 | Nuclear staining, Dilution: 1/1,000 |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11995065 | High glucose, pyruvate |
| donkey anti-goat | Biotium | 20016 or 20106 or 20048 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-mouse | Biotium | 20014 or 20105 or 20046 | Dilution: 1/1,000 |
| donkey anti-rabbit | Biotium | 20015 or 20098 or 20047 | Dilution: 1/1,000 |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FGF-2 (or bFGF) | Peprotech | 100-18B | |
| goat anti-GFAP | Abcam | ab53554 | Dilution: 1/500 |
| goat anti-SOX2 | Santa Cruz Biotecnology | sc-17320 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-ID3 | Santa Cruz Biotecnology | sc-56712 | Dilution: 1/200 |
| mouse anti-S100β | Sigma | S2532 | Dilution: 1/200 |
| Mowiol | Merck, Calbiochem | 475904 | Mounting medium |
| N2 supplement | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| Parafolmadehyde | Merck | 158127 | |
| Poly-D-Lysine | Merck, Millipore | A-003-E | Solution, 1.0 mg/mL |
| rabbit anti-Doublecortin (DCX) | Abcam | ab18723 | Dilution: 1/500 |
| rabbit anti-PDGFRα | Abcam | ab51875 | Dilution: 1/200 |
| rabbit anti-β- catenin | Abcam | ab16051 | Dilution: 1/500 |
| Triton X-100 | Merck | X100 | |
| Microscopy and image analysis | |||
| Confocal microscope | Leica | SP6 and SP8 | |
| Image analysis | NIH, USA | ImageJ | |
| Image analysis | Leica | LasX |
Referências
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