用于基于抗体的治疗分子质量数计算的开源框架
Summary
本文介绍了如何使用软件应用程序mAbScale来计算基于单克隆抗体的蛋白质疗法的质量数。
Abstract
生物治疗肿块是验证身份和结构完整性的一种手段。完整蛋白质或蛋白质亚基的质谱 （MS） 为生物制药开发的不同阶段提供了一种简单的分析工具。当MS的实验质量数在理论质量数的预定义质量数误差范围内时，蛋白质的身份得到确认。虽然有几种计算工具可用于计算蛋白质和肽分子量，但它们要么不是为直接应用于生物治疗实体而设计的，要么由于付费许可证而存在访问限制，要么需要将蛋白质序列上传到主机服务器。
我们开发了一种模块化质量数计算程序，可以轻松测定治疗性糖蛋白（包括单克隆抗体 （mAb）、双特异性抗体 （bsAb） 和抗体-药物偶联物 （ADC））的平均或单同位素质量数和元素组成。这个基于 Python 的计算框架的模块化特性将允许该平台在未来扩展到其他模式，例如疫苗、融合蛋白和寡核苷酸，并且该框架也可用于自上而下的质谱数据查询。通过创建具有图形用户界面 （GUI） 的开源独立桌面应用程序，我们希望克服在无法将专有信息上传到基于 Web 的工具的环境中使用的限制。本文介绍了mAbScale工具在不同基于抗体的治疗方式中的算法和应用。
Introduction
在过去的二十年里，生物治疗药物已经发展成为现代制药工业的中流砥柱。SARS-CoV2 大流行和其他危及生命的疾病进一步增加了对更快、更广泛地开发生物制药分子的需求 1,2,3。
生物治疗药物分子量与其他分析检测相结合，对于分子的鉴定至关重要。完整和减少的亚基质量数用于整个发现和开发生命周期，作为旨在保持质量的控制策略的一部分，如QTPP（质量目标产品简介）4中所述。
生物制药行业的分析开发在很大程度上依赖于质量测量，以使用肽图分析或多属性方法（MAM）监测进行完整质量分析和深度表征。利用现代质谱 （MS） 平台的这些技术的核心是能够提供高分辨率的精确质量 （HR/AM） 测量。大多数HR/AM仪器的质量精度在0.5-5 ppm范围内，与质量范围成正比。准确测量完整大分子质量数的能力能够快速、可靠地鉴定大分子治疗药物。由于使用大分子（>10 kDa）的典型实验条件无法获得同位素分辨率，因此必须计算平均质量数以进行比较和鉴定5,6。
典型的完整或亚基蛋白质质谱图代表了整体蛋白型图谱，其中包含翻译后修饰 （PTM） 产生的各种分子形式的复合信息以及任何一级结构差异，例如片段或序列变体。这些测量相对容易和高通量的特性使它们对表征和作为过程监测控制具有吸引力7,8。这些实验的数据分析通常要求用户定义分子形式（PTM或其他分子形式的范围）的搜索空间。对于糖基化蛋白，这种搜索空间很大程度上是由糖型异质性驱动的。多个 PTM、二硫键构型以及沿一级结构的其他变化的组合使得计算所有可能的分子形式成为一项繁琐的任务。因此，手动计算可能的分子形式是一个耗时、耗费资源的过程，极有可能出现人为错误。
在这里，我们提出了一种质量计算工具，该工具是考虑到生物治疗分子的最重要特征而开发的，例如mAb、bsAb、ADC等。该工具允许轻松合并搜索空间变量，以实现质量和元素组成的一致计算。该工具的模块化特性将使其能够进一步发展并应用于其他模式的质量计算和质量匹配。
GUI模块允许用户指定质量计算的输入，如图 1所示;具体来说，用户输入轻抗体链和重抗体链的单字母氨基酸序列。重链 N 端环化和 C 端赖氨酸剪切的常见修饰作为复选框包括在内。此外，可以通过相应的 Chem Mod 文本框从这些蛋白质链中添加/减去化学式/元素组成。这允许用户灵活地添加元素组成，包括多个翻译后修饰或ADC中的小分子有效载荷。由于大多数治疗性单克隆抗体被设计为去除轻链中的糖基化位点，因此轻链中的糖基化是可选的，可以使用 GUI 上的复选框进行指定。
抗体完整质量数分析的典型变化是亚基质量数分析，其中轻链通过减少链间二硫键从重链中分离出来。根据所用还原剂的强度，链内二硫键可能被裂解，也可能不被切割。用户可以根据IgG亚型或半胱氨酸偶联ADC9灵活地输入二硫键的总数。
该应用程序以自下而上的方式计算质量，其中首先计算单个重链和轻链的元素组成。接下来，通过调整计算出的元素组成来解释重链（HC）N端环化Lys-clipping。然后将任何指定的化学修饰应用于重链和/或轻链。根据分析类型和用户指定的二硫键模式，调整两条多肽链的氢数量。糖基化的HC和轻链（LC）（可选）质量数是根据用户的输入计算的。最后，将多个HC和LC质量数合并，并自动更新二硫键数以计算完整质量数。
对于较大的分子（如完整的蛋白质），当使用具有典型分辨能力的质谱仪时，由于加性质量缺陷，无法测量单同位素质量数。取而代之的是，测量或报告标称或平均质量 5,10,11,12,13。平均元素质量可以根据用于策划质量的来源而变化14,15。虽然元素质量的差异可能很小，但对于大分子分子量计算来说，它们加起来可以产生显著的值。软件应用程序中默认使用的平均元素质量如附表1所示。对于生物制药研发（R&D）领域等受监管的环境，保持一致的分子量非常重要，因为质量的变化可能意味着在监管备案期间分子实体发生变化。为了实现元素质量使用的一致性，软件工具中包含了元素质量字典，作为逗号分隔值 （csv） 文本文件：Element_Mass.csv（补充编码文件 1）。同样，包括mAb上常见的聚糖组合物的精选列表：聚糖.csv（补充编码文件2）。这两个文件都保存在与可执行应用程序相同的文件夹位置，用户可以修改以使用特定的元素质量数列表或聚糖库。
图 1：mAbScale 应用程序的 GUI 界面。 GUI模块允许用户指定质量计算的输入。用户输入轻抗体链和重抗体链的单字母氨基酸序列。重链 N 端环化和 C 端赖氨酸剪切的常见修饰作为复选框包含在内。化学式/元素组成可以通过相应的 Chem Mod 文本框进行添加/减去。 请点击这里查看此图的较大版本.
Protocol
Representative Results
Discussion
mAbScale提供了一个直观的用户界面，可以灵活地改变质量数和元素计算的构建模块。用户应对目标分子有基本的了解，以便使用该应用程序，得出正确的质量数，并解释结果。例如，由于完整或减少质量数的行数众多，完整或减少的质量输出表可能会让人不知所措，因为默认的聚糖数据库包含88种N-连接聚糖，这些聚糖通常存在于治疗性抗体的Fc部分，并且该应用程序计算了数据库18</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢罗伯特·舒斯特（Robert Schuster）在数据验证方面的帮助。
Materials
| Acquity UPLC system | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
| Antibody-drug conjugate (ADC) | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| BEH 200 SEC column | Waters Corp., Milford, MA | 176003904 | |
| Bispecific mAb | GlaxoSmithKline | N/A | Proprietory molecule |
| Byos | Protein Metrics, Cupertino, CA | https://proteinmetrics.com/byos/ Version 4.5 |
|
| GPMAW | GPMAW | http://www.gpmaw.com/ | |
| LC-MS grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | W6-1 | |
| mAb standard | Waters Corp., Milford, MA | 186009125 | Waters Humanized mAb Mass Check Standard |
| mAbScale | GlaxoSmithKline | Apache License, Version 2.0 | |
| Xevo G2 Q-TOF mass spectrometer | Waters Corp., Milford, MA | N/A | Modular system |
Referências
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