Uma estrutura de código aberto para o cálculo de massa de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos

Nas últimas duas décadas, os bioterapêuticos evoluíram para se tornarem um pilar da indústria farmacêutica moderna. A pandemia de SARS-CoV2 e outras condições com risco de vida aumentaram ainda mais a necessidade de desenvolvimento mais rápido e mais amplo de moléculas biofarmacêuticas ^1,2,3.

O peso molecular bioterapêutico é crítico para a identificação da molécula, em combinação com outros ensaios analíticos. As massas intactas e reduzidas das subunidades são utilizadas ao longo dos ciclos de vida de descoberta e desenvolvimento como parte das estratégias de controle que visam à manutenção da qualidade, conforme descrito no QTPP (Quality Target Product Profile)⁴.

O desenvolvimento analítico na indústria biofarmacêutica depende fortemente de medições de massa para análise de massa intacta e caracterização profunda usando mapeamento de peptídeos ou monitoramento de método multiatributo (MAM). No centro dessas técnicas que utilizam plataformas modernas de espectrometria de massa (MS) está a capacidade de fornecer medições de massa precisas de alta resolução (HR/AM). A maioria dos instrumentos HR/AM produz precisão de massa na faixa de 0,5-5 ppm, que escala com a faixa de massa. A capacidade de medir massas com precisão para moléculas grandes intactas permite a identificação rápida e confiável de terapias de moléculas grandes. Como a resolução isotópica não pode ser obtida usando condições experimentais típicas para moléculas grandes (>10 kDa), massas médias devem ser calculadas para comparação e identificação ^5,6.

Um espectro de massa de proteína intacto ou subunidade típico representa o perfil proteoforme geral, que contém informações compostas sobre as várias formas moleculares resultantes de modificações pós-traducionais (PTM) e quaisquer diferenças de estrutura primária, como clipes ou variantes de sequência. A natureza relativamente fácil e de alto rendimento dessas medições as torna atraentes para caracterização e como controles de monitoramento em processo ^7,8. A análise de dados para esses experimentos geralmente requer que o usuário defina o espaço de busca para formas moleculares (gama de PTMs ou outras formas moleculares). Para proteínas glicosiladas, esse espaço de busca é em grande parte impulsionado pela heterogeneidade de glicoformas. Combinações de múltiplos PTMs, configurações de ligações dissulfeto e outras variações ao longo da estrutura primária tornam o cálculo de todas as formas moleculares possíveis uma tarefa tediosa. Portanto, o cálculo manual das possíveis formas moleculares é um processo que consome tempo e recursos e com alto potencial de erro humano.

Aqui, apresentamos uma ferramenta de cálculo de massa que foi desenvolvida considerando as características mais importantes de moléculas bioterapêuticas, como mAbs, bsAbs, ADCs, etc. A ferramenta permite a fácil incorporação de variáveis do espaço de busca para o cálculo consistente de massas e composições elementares. A natureza modular desta ferramenta permitirá que ela seja desenvolvida e aplicada ao cálculo de massa e à correspondência de massa para outras modalidades.

O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa, como mostrado na Figura 1; Especificamente, o usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para ciclização de N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Além disso, a fórmula química/composição elementar pode ser adicionada/subtraída dessas cadeias proteicas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . Isso permite ao usuário a flexibilidade de adicionar uma composição elementar que inclui várias modificações pós-traducionais ou uma carga útil de pequena molécula no caso de um ADC. Como a maioria dos mAbs terapêuticos são projetados para remover os locais de glicosilação na cadeia leve, a glicosilação na cadeia leve é opcional e pode ser especificada usando uma caixa de seleção na GUI.

Uma variação típica na análise de massa intacta para anticorpos é uma análise de massa de subunidade reduzida, onde a cadeia leve é destacada da cadeia pesada reduzindo as ligações dissulfeto entre cadeias. Dependendo da força do agente redutor utilizado, as ligações dissulfeto intrachain podem ou não ser clivadas. Os usuários têm a flexibilidade de inserir o número total de ligações dissulfeto dependendo do subtipo de IgG ou no caso de um ADC conjugado com cisteína⁹.

O aplicativo calcula massas de uma maneira ascendente, na qual as composições elementares são primeiro calculadas para as cadeias pesadas individuais e cadeias leves. Em seguida, a ciclização N-terminal de cadeia pesada (HC) Lys-clipping é contabilizada ajustando as composições elementares calculadas. Quaisquer modificações químicas especificadas são então aplicadas às cadeias pesadas e/ou leves. Dependendo do tipo de análise e dos padrões de ligação dissulfeto especificados pelo usuário, o número de hidrogênios é ajustado para as duas cadeias polipeptídicas. As massas de HC glicosilado e de cadeia leve (LC) (opcional) são calculadas com base na entrada do usuário. Finalmente, múltiplas massas HC e LC são combinadas, e os números de ligação dissulfeto são atualizados automaticamente para o cálculo da massa intacta.

Com moléculas maiores, como proteínas intactas, as massas monoisotópicas não podem ser medidas devido ao defeito de massa aditivo ao usar espectrômetros de massa com poder de resolução típico. Em vez disso, massas nominais ou médias são medidas ou relatadas 5,10,11,12,13. As massas elementares médias podem variar de acordo com a fonte utilizada para as massas curadas^14,15. Embora as diferenças nas massas elementares possam ser pequenas, elas podem somar valores significativos para cálculos de peso molecular de moléculas grandes. As massas elementares médias usadas por padrão no aplicativo de software são mostradas na Tabela Suplementar 1. Para ambientes regulados, como o campo de pesquisa e desenvolvimento biofarmacêutico (P&D), é importante manter massas moleculares consistentes, pois mudanças nas massas podem implicar mudanças na entidade molecular durante os registros regulatórios. Para permitir a consistência no uso de massas elementares, um dicionário de massas elementares é incluído com a ferramenta de software como um arquivo de texto de valor separado por vírgula (csv): Element_Mass.csv (Supplementary Coding File 1). Da mesma forma, uma lista curada de composições de glicanos tipicamente vistas em mAbs está incluída: Glycan.csv (Supplementary Coding File 2). Ambos os arquivos são salvos no mesmo local de pasta como um aplicativo executável e podem ser modificados pelo usuário para usar uma lista de massa elementar específica ou biblioteca glicana.

Figura 1: Interface GUI para o aplicativo mAbScale. O módulo GUI permite que o usuário especifique a entrada para o cálculo de massa. O usuário insere sequências de aminoácidos de letra única para as cadeias de anticorpos leves e pesadas. Modificações comuns para a ciclização N-terminal de cadeia pesada e clipagem de lisina C-terminal estão incluídas como caixas de seleção. Fórmulas químicas/composições elementares podem ser adicionadas/subtraídas através da respectiva caixa de texto Chem Mod . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.