Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

Pour la plupart des cellules eucaryotes, les mitochondries sont des organites essentiels, car elles jouent un rôle crucial dans de nombreux processus cellulaires. Tout d’abord, les mitochondries sont les principaux fournisseurs d’énergie des cellules¹. Les mitochondries sont également impliquées dans la régulation de l’homéostasie cellulaire (par exemple, l’oxydox^{intracellulaire 2} et l’équilibre calcique³), la signalisation cellulaire^4,5, l’apoptose ⁶, la synthèse de différents composés biochimiques ^7,8 et la réponse immunitaire innée⁹. Le dysfonctionnement mitochondrial est associé à divers états pathologiques et maladies humaines¹⁰.

Le fonctionnement des mitochondries dépend de l’information génétique située dans deux génomes distincts : le génome nucléaire et le génome mitochondrial. Le génome mitochondrial code un petit nombre de gènes par rapport au génome nucléaire, mais tous les gènes codés par l’ADNmt sont essentiels à la vie humaine. La machinerie protéique mitochondriale nécessaire au maintien de l’ADNmt est codée par l’ADNn. Les composants de base du réplisome mitochondrial, ainsi que certains facteurs de biogenèse mitochondriale, ont déjà été identifiés (examinés dans des recherches antérieures^11,12). Cependant, les mécanismes de réplication et de maintien de l’ADN mitochondrial sont encore loin d’être compris. Contrairement à l’ADNn, le génome mitochondrial existe en plusieurs copies, ce qui fournit une couche supplémentaire pour réguler l’expression des gènes mitochondriaux. On en sait beaucoup moins actuellement sur la distribution et la ségrégation de l’ADNmt au sein des organites, dans quelle mesure ces processus sont régulés et, le cas échéant, quelles protéines sont impliquées¹³. Le schéma de ségrégation est crucial lorsque les cellules contiennent une population mixte d’ADNmt de type sauvage et muté. Leur distribution inégale peut conduire à la génération de cellules avec une quantité néfaste d’ADNmt muté.

Jusqu’à présent, les facteurs protéiques nécessaires au maintien de l’ADNmt ont été identifiés principalement par des méthodes biochimiques, des analyses bioinformatiques ou par des études associées à la maladie. Dans ce travail, afin d’assurer une forte chance d’identifier les facteurs qui ont précédemment échappé à l’identification, une stratégie différente est décrite. La méthode est basée sur le marquage de l’ADNmt pendant la réplication ou la réparation avec la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU), un analogue nucléosidique de la thymidine. BrdU est facilement incorporé dans les brins d’ADN naissants lors de la synthèse de l’ADN et, en général, est utilisé pour surveiller la réplication de l’ADN nucléaire¹⁴. Cependant, la procédure développée ici a été optimisée pour détecter BrdU incorporé dans l’ADNmt en utilisant l’immunofluorescence des anticorps anti-BrdU.

L’approche permet la quantification à haut débit de la synthèse et de la distribution de l’ADNmt dans des cellules humaines cultivées in vitro. Une stratégie à haut débit est nécessaire pour effectuer des essais dans différentes conditions expérimentales dans un temps relativement court; Par conséquent, il est proposé dans le protocole d’utiliser un format multipuits pour la culture cellulaire et la microscopie à fluorescence automatisée pour l’imagerie. Le protocole comprend la transfection de cellules HeLa humaines avec une bibliothèque de siRNA et la surveillance ultérieure de la réplication ou de la réparation de l’ADNmt à l’aide du marquage métabolique de l’ADN nouvellement synthétisé avec BrdU. Cette approche est combinée avec l’immunomarquage de l’ADN à l’aide d’anticorps anti-ADN. Les deux paramètres sont analysés à l’aide de la microscopie quantitative à fluorescence. De plus, les mitochondries sont visualisées avec un colorant spécifique. Pour démontrer la spécificité du protocole, la coloration BrdU a été testée sur des cellules dépourvues d’ADNmt (cellules rho0), sur des cellules HeLa lors du silençage de facteurs de maintenance de l’ADNmt bien connus et sur des cellules HeLa après traitement avec un inhibiteur de la réplication de l’ADNmt. Les niveaux d’ADNmt ont également été mesurés par une méthode indépendante, à savoir la qPCR.