Summary

Preparato a base di metanolo a montaggio intero per lo studio delle cellule gangliari retiniche

Published: April 07, 2023
doi:

Summary

Il metanolo può essere utilizzato come mezzo fisso ausiliario per preparazioni retiniche a montaggio intero e conservazione a lungo termine, utile per lo studio delle cellule gangliari retiniche.

Abstract

Le cellule gangliari retiniche (RGC), che sono i neuroni di proiezione della retina, propagano le informazioni visive esterne al cervello. I cambiamenti patologici nelle RGC hanno una stretta relazione con numerose malattie degenerative della retina. L’immunocolorazione retinica a montaggio intero è frequentemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni di sviluppo e patologiche della retina. In alcune circostanze, alcuni preziosi campioni di retina, come quelli di topi transgenici, potrebbero dover essere conservati per un lungo periodo senza influenzare la morfologia o il numero di RGC. Per risultati sperimentali credibili e riproducibili, l’utilizzo di un mezzo di conservazione efficace è essenziale. Qui, descriviamo l’effetto del metanolo come mezzo fisso ausiliario per i preparati retinici a montaggio intero e la conservazione a lungo termine. In breve, durante il processo di isolamento, il metanolo freddo (-20 °C) viene pipettato sulla superficie della retina per aiutare a fissare i tessuti e facilitarne la permeabilità, quindi le retine possono essere conservate in metanolo freddo (-20 °C) prima di essere immunocolorate. Questo protocollo descrive il flusso di lavoro di isolamento della retina e il protocollo di conservazione dei campioni di tessuto, che è utile e pratico per lo studio delle RGC.

Introduction

Le cellule gangliari retiniche (RGC) sono gli unici neuroni di proiezione nella retina e integrano e trasmettono informazioni visive esterne al cervello1. Molte malattie neurodegenerative come il glaucoma e la neuropatia ottica traumatica sono caratterizzate da danni irreversibili e perdita di RGC 2,3. L’analisi dei cambiamenti morfologici e quantitativi delle RGC è un passo cruciale nel determinare come le malattie neurodegenerative si sviluppano e avanzano 4,5.

Il saggio di immunofluorescenza indiretta è un metodo ampiamente accettato per monitorare la distribuzione delle proteine e il conteggio delle cellule. In laboratorio, l’immunocolorazione retinica a montaggio intero è comunemente utilizzata negli studi sperimentali sulle RGC per valutare le condizioni fisiologiche e patologiche della retina6. I marcatori più comuni utilizzati per la quantificazione RGC nell’intera retina includono Brn3a, RNA binding protein with multiple splicing (RBPMS), e così via 7,8. La caratterizzazione della quantità e della distribuzione delle RGC richiede un’immunocolorazione retinica a montaggio intero di alta qualità. Generalmente, nei protocolli di immunocolorazione, la retina viene immersa in fissativi chimici prima di essere incubata in anticorpi. I fissativi ideali non dovrebbero cambiare la forma delle cellule, l’accessibilità o l’affinità degli epitopi per gli anticorpi o le dimensioni lineari del tessuto 9,10.

A causa della complessa struttura della retina, problemi come la fragilità e il ripiegamento della retina, così come alcune difficoltà comuni tra cui il restringimento delle cellule e nuclei poco chiari, sono inclini a verificarsi quando si realizza un cerotto retinico a montaggio intero, che ha un impatto negativo sulla ricerca sperimentale. Inoltre, non tutte le retine sono immunocolorate immediatamente, specialmente quando si tratta di retine di topi transgenici con prezzi costosi che sono di origine preziosa, rendendo necessaria la conservazione dei campioni retinici extra per un ulteriore utilizzo.

La soluzione fissativa appropriata può fissare rapidamente il tessuto, evitare l’autolisi tissutale, preservare la normale morfologia e struttura delle cellule tissutali e mantenere l’antigenicità delle proteine e di altre sostanze10. Allo stato attuale, la fissazione a base di formaldeide è stata ampiamente utilizzata in vari tessuti, tra cui retine separate, conchiglie oculari emisecate e bulbi oculari interi10. Il restringimento tissutale e l’alterazione morfologica delle cellule sono le due sfide critiche incontrate dopo l’immersione in formaldeide11. Inoltre, stanno emergendo sempre più formulazioni di fissazione modificate per massimizzare la conservazione delle proprietà originali della retina e delle cellule bersaglio 9,10. Diversi trattamenti di fissazione retinica possono influenzare la struttura retinica, l’immunogenicità delle proteine, l’eccitazione della fluorescenza e il ciclo di tempra dell’attenuazione in modo diverso12,13. Le retine fissate con la soluzione di Davidson sono morfologicamente più intatte rispetto a quelle fissate con formalina, ma la soluzione di Davidson è meno compatibile con alcuni anticorpi, come la molecola 112 dell’adattatore legante il calcio ionizzato con marcatore microgliale. Considerando la natura fragile delle retine, i ricercatori si chiederanno naturalmente se l’integrità della retina, così come le proprietà e la morfologia delle cellule bersaglio, cambieranno dopo la conservazione a lungo termine. Tuttavia, i possibili effetti della soluzione di fissazione sulla morfologia delle cellule retiniche e RGC dopo la conservazione per diversi mesi sono stati raramente riportati. L’ottimizzazione della fissazione retinica è fondamentale per la valutazione e la conservazione delle RGC.

Forniamo una descrizione dettagliata di un metodo affidabile e tecnicamente semplice che utilizziamo per la colorazione retinica murina a montaggio intero. Il nostro metodo enfatizza la corretta preparazione e conservazione delle retine per l’indagine RGC, tenendo conto della necessità di conservazione a lungo termine del tessuto retinico e degli aspetti specifici della formazione o della degradazione dei fluorofori.

Protocol

Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente se non diversamente indicato. Tutti i topi C57BL / 6J utilizzati sono stati ottenuti dal Laboratory Animal Center dell’Università di Wuhan e tutti gli esperimenti correlati sono stati approvati dal Comitato per l’etica degli esperimenti sugli animali dell’Università di Wuhan. Sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo la sofferenza dei topi. 1. Enucleazione e fissazione degli occhi Eutanasia dei …

Representative Results

Dopo la dissezione, la retina dovrebbe apparire come un trifoglio piatto a quattro foglie. In questo studio, utilizzando il protocollo sopra descritto, la retina è diventata bianca dopo l’aggiunta di metanolo (Figura 1). Nel frattempo, la retina è cambiata da morbida a flessibile e piatta. Successivamente, gli RGC sono stati etichettati con anti-RBPMS8. Quattro campi di immagini sono stati presi nella retina a montatura intera (n = 3) utilizzando un microscopio conf…

Discussion

La fissazione è un passaggio essenziale per preservare la retina, che può influire su eventuali successive indagini RGC basate sulla morfologia. Una fissazione di successo cattura rapidamente la struttura e lo stato delle retine al momento di esporle al mezzo di fissaggio, che è fondamentale per ulteriori analisi. Sebbene la formaldeide sia stata considerata uno degli agenti fissanti più comuni per la fissazione e la conservazione di tessuti e cellule, la formaldeide da sola non sempre funziona bene come fissativo ch…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato dall’Hubei Key Laboratories Opening Project (sovvenzione n. 2021KFY055), dalla Natural Science Foundation of Hubei Province (grant n. 2020CFB240) e dai Fundamental Research Funds for the Central Universities (grant no. 2042020kf0065).

Materials

24-well cell culture cluster Costar Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate Labedit Company Incubation antibody
Adhesion microscope slides Citotest Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant Servicebio G1401 Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin) Servicebio GC305010 Blocking reagent
Confocal microscope OLYMPUS Apply 40x objective lens
Curved scissors Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools
Dissecting microscope RWD Life science Co.,LTD  77001S Dissecting tools
Forceps Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools
Methanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. 20210624 GC≥99.5%
Nail polish SecheVite Sealing agent
Needles  Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd. Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution Servicebio G1101 Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4) Servicebio G0002 Rinse the eyeball 
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS) PhosphoSolutions Cat. #1832-RBPMS For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 706-165-148 For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd. Dissecting tools

Referências

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Citar este artigo
Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. Methanol-Based Whole-Mount Preparation for the Investigation of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (194), e65222, doi:10.3791/65222 (2023).

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