Placering af ekstrakranielle stimulerende elektroder og måling af cerebral blodgennemstrømning og intrakranielle elektriske felter hos bedøvede mus

Transkraniel elektrisk stimulering (tES; med sinusbølgestimulering, tACS) er en almindelig, ekstern, ikke-invasiv tilgang til hjernens neuromodulation ^1,2. Tidligere antog vi, at tES (og især tACS) ved visse doser kan øge den cerebrale blodgennemstrømning (CBF) i de underliggende hjerneområder³. Endvidere kan der eksistere et dosis-responsforhold mellem enten den anvendte eksterne strøm eller det intrakranielle elektriske felt og de resulterende CBF-responser. Imidlertid har de fleste kliniske stimuleringsprotokoller fokuseret på et maksimalt behageligt hudniveau af stimulering (dvs. ~ 2 mA) i planlagte perioder (dvs. 30-45 min) som en behandlingsprotokol ^4,5. Hos gnavere er det muligt at anvende invasive, ekstrakranielle hjerneelektroder påført direkte på kraniet for at undersøge de elektriske felter i hjernen induceret af tES⁶. Derfor er målet med denne tilgang at bestemme virkningerne af intensiteten af tACS ved relevante frekvenser på CBF-ændringer med hensyn til dosis-respons-forholdet. Denne dosis-responskurve er baseret på en kortvarig fysiologisk biomarkør-direkte måling af CBF - i forhold til det elektriske felt, der pålægges hjernen³. Vi har tidligere vist, at der ved større amplituder, typisk uden for rækkevidden af elektriske felter i hjernen induceret af tACS klinisk, er en næsten lineær korrelation mellem det inducerede elektriske felt og CBF i cortex³. Imidlertid kan stimulering med mindre felt (dvs. 1-5 mV/mm intensitet) være mere relevant og gennemførlig til brug hos mennesker; derfor har vi ændret vores teknikker til at opdage mindre CBF-ændringer.

Dette papir beskriver en protokol til analyse af virkningerne af tES vekslende sinusstrømme (tACS) med lavere feltstyrke (tACS) på CBF (dvs. 0,5-2,0 mA strøm, 1-5 mV / mm elektrisk felt), som kan tolereres af vågne gnavere⁵. Denne protokol involverer brugen af ny laserspeckle-billeddannelse under tACS såvel som dobbelte intrakranielle glaselektroder til at bestemme både spredningen af aktiv tACS i hjernen (som overvåget af CBF) og den intrakranielle elektriske feltintensitet, som vises både som et diagram og et faktisk eksperimentelt fotografi (figur 1). Der er mange mulige fysiologiske virkninger af tES i hjernen, herunder direkte neuronal modulation, neural plasticitet og astrocytaktivering ^7,8. Selvom CBF er blevet målt med tDCS ^9,10, var disse målinger langsomme, indirekte og utilstrækkelige til at vurdere dosis-respons-funktionen i hjernen. Derfor kan vi ved at bruge passende kortsigtede biomarkører (dvs. CBF, elektriske felter) og hurtige tænd / sluk-sekvenser af tACS nu estimere dosis-respons-funktionen mere præcist. Desuden kan vi anvende forskellige teknikker til at måle CBF, herunder både fokale Doppler-sonder (LD) og laserspeckle imaging (LSI) med definerede interesseområder.

Figur 1: Transkraniel stimuleringsdiagram og fotografisk eksempel . (A) Diagram over transkraniel stimuleringsopsætning. Diagrammet viser et musekranium med koronale og sagittale suturer. De transkranielle elektroder placeres sideværts og symmetrisk på kraniet og monteres med kirurgisk lim og ledende pasta mellem elektroderne og kraniet. Disse elektroder er forbundet til en menneskekompatibel, konstantstrømsstimuleringsenhed, som kan specificere frekvensen, amplituden og varigheden af stimuleringen. Til vurdering af intrakranielle elektriske felter placeres bilaterale glaselektroder (~ 2 MΩ) i hjernebarken (dvs. inden for 1 mm fra det indre aspekt af kraniet gennem små burrhuller), og disse er forseglet med mineralolie og har AgCl-grunde i nakkemusklen (vist som større ledninger i midten begravet i det subkutane halsvæv). Disse glaselektroder er forbundet til en DC-forstærker, og deres udgange optages via en digitizer med mindst fire kanaler. Bilaterale laser Doppler-sonder placeres også på kraniet til optagelser. Hele kraniet er også afbildet med enten en laser speckle imaging enhed eller en høj opløsning (mindst 1.024 x 1.024 pixels, 12-14 bit pixel dybde) afkølet kamera til iboende optisk signal detektion. Hæmoglobinisosbestisk frekvens vælges typisk (dvs. 562 nm) til belysning til blodgennemstrømningsbilleddannelse. (B) Et nærbillede af et faktisk eksperiment, der viser de bilaterale laserdopplersonder (til venstre), de (bilaterale) intrakranielle glasoptagende mikroelektroder placeret gennem grathullerne og med tACS-stimulerende elektroder sideværts. Forkortelse: tACS = transkraniel vekselstrømsstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Som en måde at vurdere mekanismerne på kan vi også forhøre interaktioner med andre fysiologiske processer, der også ændrer CBF, såsom K ⁺-induceret spredningsdepolarisering¹¹. I stedet for planlagte sessioner på regelmæssige tidspunkter er det også muligt at udvikle et lukket kredsløbssystem baseret på yderligere biomarkører for en række sygdomme, som det er blevet foreslået for epilepsibehandling¹² (dvs. kliniske Neuropace-enheder). For eksempel er lukket hjernestimulering for Parkinsons sygdom almindeligvis baseret på de iboende, unormale lokale feltpotentialer (LFP'er), der er iboende for denne sygdom i mangel af tilstrækkelig dopamin (typisk β-bånds LFP'er)¹³.

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee ved Duke University eller den tilsvarende lokale myndighed, der regulerer forskning, der involverer dyr. Se materialefortegnelsen for detaljer om alle materialer, instrumenter og udstyr, der anvendes i denne protokol.

1. Forberedelse af instrumenter

1. Sørg for, at alle de nødvendige genstande og kirurgiske instrumenter er på plads (figur 2): hovedbundsrensningsopløsning (alkoholpuder), tape, tang, saks og en boremaskine til placering af de små (0,5 mm) burrhuller.
2. Forbered de ekstrakranielle overfladeelektroder til kraniepåføring, og sørg for, at eventuel kirurgisk lim er blevet renset fra dem, hvis de tidligere er blevet brugt.
3. Kontroller impedansen af disse tACS-elektroder direkte, før du påfører dem på kraniet. Til dette skal du bruge den indbyggede målefunktion af tACS-stimulatoren med begge elektroder placeret i et saltvandsbad.
   BEMÆRK: Den foretrukne impedans er <5 KΩ pr. Elektrodepar for at tillade tilstrækkelig strøm at blive ført over kraniet. Stimulatorenheden kontrollerer impedansen, inden der leveres konstantstrømsimpulser og giver værdien direkte.

Figur 2: Et fotografi af den nødvendige instrumentering, herunder dissekeringsinstrumenter og saks, til forberedelse af den ekstrakranielle stimulering. 1. Mikrodissekerende saks, 11,5 cm; 2. Tang, 11,5 cm, let kurve, savtakket; 3. Dumont #7 tang, buet; 4. Dumont # 5 tang; 5. Micro curette, 13 cm; 6. Q-tips; 7. Kirurgisk tape; 8. Alkoholpuder. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Forberedelse af dyret til operation

BEMÆRK: Til disse eksperimenter brugte vi 14 C57BL/6 kontrolmus mellem 12 uger og 33 uger, hvoraf fem var hanmus og ni var hunner.

1. Bedøv dyret i et induktionskammer med isofluran i 30%_O2 ved ~ 1,5 l / min, med ~ 4% oprindeligt at inducere og ~ 1,25% -1,5% at opretholde på et anæstesiniveau med spontan vejrtrækning og tilstrækkelig til at eliminere haleklemmeresponsen.
2. Overfør dyret til den stereotaksiske ramme efter induktion, og fastgør derefter hovedet i næsekeglen og ørestængerne til den efterfølgende elektrodeapplikation og grathulprocedure (figur 1 og figur 3).
3. Tilslut næsekeglen på den stereotaksiske ramme til fordamperen via et indløb og til et udløb for at fjerne eventuelle isofluranrester gennem et skyllesystem (f.eks. Trækul eller et vakuum). Sørg for, at der ikke er luftlækager fra næsekeglen, både for at opretholde anæstesiniveauet med isofluoranen og for at forhindre utilsigtet lækage i rumluften (figur 3).
4. Kontroller musens position i den stereotaksiske ramme, herunder næsekeglens position, for at tillade spontan åndedræt uden intubation samt passende anæstesigenopretning og -rensning for at beskytte forskningspersonalet (figur 3).
5. Placer sonderne til måling af puls, pulsiltmætning (puls OX), blodtryk og temperatur på dyret; Sørg for, at den mindste pulsiltning er 90%, og pulsen er >450/min (alarmens nedre grænse vises som 380 impulser/min). Disse parametre registreres under proceduren med regelmæssige mellemrum eller kontinuerligt, afhængigt af registreringssystemet (figur 3).
6. Før du starter proceduren, skal du kontrollere dyrets sedationsniveau ved hjælp af (for eksempel) en tåklemme for at kontrollere reflekserne. Hvis der ikke er nogen refleks, er niveauet af sedation optimalt, så længe dyret opretholder spontan åndedræt og tilstrækkelig pulsoxygenering. Hvis der er en refleks, skal du øge leveringen af isofluran for at uddybe anæstesiniveauet og derefter kontrollere refleksen igen. Kontinuerligt observere og overvåge dyrets respirationsfrekvens og justere isofluranindgivelsen i overensstemmelse hermed.
7. Barber hovedbundshårene eller fjern håret med hårfjerningscreme (rengør den resterende creme med alkoholpudepassager).
8. Påfør øjensalve, og rengør derefter hovedbunden aseptisk med tre passager jod og alkohol inden udskæring ved hjælp af en saks.

Figur 3: Et billede af dyret i den stereotaktiske ramme, med kraniet blottet og kun tACS-stimulatorelektroderne på plads (før burrhullets placering). Bemærk blodtryksenheden omkring halen og pulsoximeteret på poten med aflæsningen til venstre. Der er skyllerør til isofluran omkring næsekeglen. Forkortelse: tACS = transkraniel vekselstrømsstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Kirurgisk procedure: Anvendelse af stimulerende elektroder og fremstilling af burrhullerne

1. For en terminal undersøgelse skal du fjerne hovedbunden ved hjælp af kirurgisk saks og udsætte kraniet ~ 3 mm fra lambdoid sutur kausalt og ~ 3 mm frontal til bregma for at udsætte en del af den bageste frontale sutur. Punktafgifter hovedbunden parietalt for at udsætte den indledende del af den temporale muskel på begge sider (figur 3).
2. Fjern eventuelt resterende subkutant bindevæv, så kraniet er rent og tørt til påføring af de stimulerende elektroder.
3. Påfør ledende gel eller pasta på siden af elektroderne, der vil være i kontakt med kraniet, og fastgør elektroderne med kirurgisk superlim rundt om kanten på intermitterende steder.
   BEMÆRK: Lad ikke den ledende gel forstyrre den kirurgiske superlim for at give en bedre binding til kraniets overflade. Den ydre overflade af elektroderne kan også isoleres (fra hovedbunden, hvis denne lukkes under en overlevelsesoperation) ved hjælp af kirurgisk superlim.
4. Brug enten kommercielle flade elektroder, eller opret interne elektroder ved hjælp af isoleret ledning med en diameter på 100 μm (loddet til pladen) og en 1 mm x 3 mm fleksibel, isoleret (på en overflade) kobberplade skåret i henhold til kraniets størrelse.
5. Påfør lidokainpasta på den temporale muskel og hovedbund på begge sider uden at forstyrre elektroderne for at reducere muskel- og perifer nerveaktivering.
6. Når de ekstrakranielle stimulerende elektroder er på plads 4 mm sideværts til hver side af kraniet (mellem bregma og lambda), bores to 0,5 mm burrhuller til glaselektroderne 2 mm på hver side af midterlinjen, 4 mm fra hinanden, ortogonale til sagittalsuturen (figur 1). Fyld disse burrhuller med steril mineralolie for at forhindre strømindtrængning i kraniet fra de ekstrakranielle elektroder.
7. Hvis det ønskes for et bestemt eksperiment for at fremkalde spredningsdepression (dvs. kaliuminduceret spredningsdepression [K + -SD]), tilsættes på højre side af kraniet et tredje 0,5 mm burrhul ~ 1,5 mm rostral til koronal sutur og ~ 1 mm lateral til den bageste frontale sutur. Fyld dette grathul med saltvand til senere 1 M KCl-påføring for at inducere K+-SD.
8. Test impedansen af de ekstrakranielle stimulerende elektroder både før burrhulsplaceringen (og sammenlignet med de samme elektroder placeret i et saltvandsbad) og efter burrhulsplaceringen for at kontrollere, at burrhullerne ikke forstyrrer strømmen ind i hjernen (dvs. sørg for, at modstanden er uændret).
   BEMÆRK: Impedansmålingen leveres direkte af den stimulerende enhed. Generelt har vi fundet, at den samlede systemimpedans (dvs. fra de ekstrakranielle elektroder over kraniet / hjernevejen, typisk ~ 3 KΩ) er relativt konstant uanset burrhullerne og glasmikroelektroderne, hvilket indikerer, at der er minimal strømlækage direkte ind i hjernen gennem burrhullerne.
9. Placer de kroniske transkranielle stimuleringselektroder til kronisk stimulering på en lignende måde. I dette tilfælde skal du isolere den ydre overflade af elektroderne, lukke hovedbunden og enten tunnelere de isolerede ledninger ud gennem hovedbunden eller føre dem ind i et fast hovedtrin monteret på kraniet.

4. Fysiologisk procedure

1. Begynd med de fysiologiske aspekter af forsøget, når dyret er fuldt forberedt på det fysiologiske eksperiment, der ikke overlever. Oprethold anæstesiniveauet, der er tilstrækkeligt til både spontan åndedræt og tilstrækkelig puls Ox, åndedræts- og pulsniveauer.
2. Mål CBF som følge af ekstrakraniel stimulering ved hjælp af en af følgende to metoder.
   1. Placer musen under en laserspeckle billeddannelsesenhed med eller uden intrakranielle optageelektroder for at måle det intrakranielle elektriske felt under stimuleringsepisoder (figur 3).
   2. Overfør dyret til et fysiologisk præparat til placering af bilaterale laser Doppler-sonder og intrakranielle elektroder for at måle det intrakranielle elektriske felt under stimuleringsepisoder (figur 1).

5. Placering af bilaterale laserdoppler- og glaselektroder

1. Overfør dyret til et mikroskopstadium til anvendelse af bilaterale laser Doppler-sonder. Placer sonderne på toppen af kranieoverfladen mellem de bilaterale burrhuller og koronal sutur (figur 1).
2. Fyld trukket glasmikroelektroder (~ 0,1 μM, 2-6 MΩ impedans) med 0,2 M NaCl, og placer dem ved hjælp af en mikromanipulator i de to burrhuller, der er placeret sideværts til sagittalsuturen ^3,14 (figur 1).
   BEMÆRK: Disse grathuller er mellem de to symmetriske ekstrakranielle stimuleringselektroder (figur 1).
3. Når de er indsat i hjernen, skal du sikre dig, at disse glasmikroelektroder er ~ 1 mm i hjernebarken. Udfør dybdeprofiler på forskellige symmetriske dybder. Genopfyld burrhullerne med steril mineralolie for at isolere denne vej til strømstrøm.

6. Stimuleringsprocedure og måling af intensiteten af transkraniel vekselstrømsstimulering (tACS) eller transkraniel jævnstrømsstimulering (tDCS)

1. Optag kontinuerlige data fra de dobbelte Doppler-lasersonder på kraniet og de to intrakranielle mikroelektrodeudgange (optaget ved hjælp af en DC-forstærker med hovedtrin) ved hjælp af et digitaliseringssystem og software med mindst fire kanaler (med en samplinghastighed på 1 KHz). Når alle værdierne er registreret over en tilstrækkelig stabil baseline-varighed (dvs. >10 min), testes den ekstrakranielle stimulering.
   BEMÆRK: Figur 4 viser et eksempel på de fire kanaler med de to intrakranielle optageelektroder i de øverste kanaler og CBF-responsen i de nederste kanaler.
2. Anvend korte perioder med tænd/sluk-stimulering ved forskellige amplituder (dvs. 20-30 s, 0,5-2,0 mA i det tolerable område) for at opnå en klar baseline før og efter stimulering (figur 4). Påfør stimuleringen mellem de to kraniet tACS-elektroder på hver side (figur 1) ved hjælp af en kommerciel, menneskekompatibel stimulerende enhed, der leverer en konstant strøm.
3. Overhold nøje musen for muskeltrækninger eller andre reaktioner på tACS, såsom en ændring i pulsen eller åndedrættet, for at skabe en øvre grænse for tolerabilitet (generelt ~ 2 mA).
4. Fortsæt med at overvåge impedansen over elektroderne med stimuleringsepoker for at sikre, at denne er konstant.
5. Tilsæt en lille mængde (2-3 μL) 1 M KCl til det forreste grathul¹⁴ for at fremkalde spontane K+-SD-hændelser. Disse genererer et stort CBF-respons og interaktioner mellem K+-SD-induceret CBF-respons og CBF-respons. Anslå tACS CBF-responsen ved at anvende tACS-stimuleringen både før og efter forekomsten af SD.
6. Ved afslutningen af eksperimentet udføres eutanasi gennem en overdosis isofluran (5%) og halshugges derefter, når åndedrættet og hjerteslagene er ophørt.

Figur 4: Data, der viser fire kanaler med rådata som reaktion på tACS med lav intensitet. Dataene er arrangeret med de øverste to rækker som de intrakranielle, direkte DC-elektriske optagelser (mærket som Input 1 [IN0] og input 2 [IN1]) og de nederste to rækker som de bilaterale laserDoppler-optagelser af cerebral blodgennemstrømning. Bemærk, at svarene er asymmetriske mellem højre (øverste) og venstre (nedre) elektriske og cerebrale blodgennemstrømningsspor. (A) Et lille respons (16% stigning i blodgennemstrømningen) som reaktion på en 1,2 mV/mm 20 s stimulus (0,75 mA). (B) Et større respons (21% stigning i blodgennemstrømningen) som reaktion på en 1,4 mV / mm stimulus (1,0 mA). Forkortelse: tACS = transkraniel vekselstrømsstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

7. Beregning af det elektriske felt

1. Mål forskellen i output fra de to intrakranielle elektroder ved hjælp af forskellen i halvbølgen (en cyklus) af de to registrerede sinusbølger (de to øverste spor i figur 4). Denne forskel (mV) divideres med afstanden mellem de to elektroder (mm, her ~4 mm, men målt direkte i hvert tilfælde) for at nå frem til feltstyrken (mV/mm)^3,6.

Repræsentative resultater er vist i figur 4, figur 5 og figur 6. Figur 4 viser et eksempel på de fire kanaler med de to intrakranielle optageelektroder på de øverste kanaler og CBF-responserne på de nederste kanaler. tACS er symmetrisk på tværs af kraniet, men generelt er det intrakranielle feltrespons lidt asymmetrisk for påførte vekselstrømme, hvor den ene side viser et større respons end den anden (figur 4). CBF-responset på tACS elektrisk stimulering³ er generelt fasisk ved højere amplituder (dvs. 0,75-2,0 mA, figur 4B) og mere konstant ved lavere amplituder (0,5-0,75 mA, figur 4A). Da CBF-optagelserne (med enten LSI- eller LD-målinger) er støjende og viser spontane udsving ved lavere amplituder, har vi i gennemsnit 5-10 epoker af tACS for at hjælpe med at reducere de spontane udsving (figur 4).

Figur 5 viser cerebral blodgennemstrømningsrespons ved hjælp af laser speckle billeddannelse. Billedet øverst til venstre viser en ikke-trukket visning, mens de efterfølgende billeder til venstre er det direkte output fra laserspeckle-billeddannelsesenheden. Billederne til højre er forskellige billeder, der sammenligner før og efter stimuleringen. Det midterste billede til højre viser den diffuse forskel i cerebral blodgennemstrømning forårsaget af stimuleringen. Grafen øverst til højre viser et interesseområde mellem de stimulerende elektroder med en klar stigning i intensitet i løbet af stimuleringstiden.

Figur 5: Laser speckle kraniet billeddannelse af cerebral blodgennemstrømning bilateralt under tACS ved 1,0 mA med en række billeder, der viser omfanget af cerebral blodgennemstrømning ekstraudstyr. Billedet øverst til venstre viser et farvebillede af musekraniet ved baseline; skalabjælke = 5 mm. Serien øverst til højre viser responsen på 1,2 mV/mm stimulering over tid; Bemærk det temmelig støjende område af interesse blandt billederne. De venstre billeder er direkte farvefluxbilleder fra laserpletbilleddannelsen. De øverste farvebilleder er før stimuleringen, de midterste billeder er under stimuleringens højdepunkt, og de nederste billeder er efter tilbagevenden til baseline. De rigtige billeder er forskelsbilleder (med baseline trukket fra), der viser den diffuse karakter af den øgede CBF som reaktion på stimuleringen, hvilket kan noteres jævnt i hele cortex (rødt i det midterste billede, +15%); Den efterfølgende tilbagevenden til grundlinjen vises på de nederste billeder. Farveskalalinjen viser ændringer på ±15% forskel. Forkortelse: tACS = transkraniel vekselstrømsstimulering. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6A viser en sammenligning af responsen på blodgennemstrømningen i hjernen som funktion af alderen med et signifikant øget respons hos de yngre dyr. Figur 6B viser, at dette især gælder for de større strømme, hvor de yngre dyr viser en langt mere robust respons end de ældre dyr.

Figur 6: Cerebral blodgennemstrømning reaktioner. (A) Ændringerne i cerebral blodgennemstrømning som funktion af musealderen. Bemærk det signifikant større respons hos de yngre dyr (12-14 uger) end hos de ældre dyr (28-33 uger). (B) Disse forskelle strækker sig også til de højere strømniveauer af tACS-stimulering; Faktisk er der ved 1,5 og 2,0 mA et meget større cerebral blodgennemstrømningsrespons hos de yngre dyr. Den anvendte statistiske test var en ikke-parametrisk sammenligning (rangsum; n = 13 repræsentative eksperimenter) med et resultat på p < 0,005 for forskellene mellem de yngre og ældre grupper. Forkortelser: tACS = transkraniel vekselstrømsstimulering; CBF = cerebral blodgennemstrømning. Klik her for at se en større version af denne figur.

CBF-responsen baseret på tACS-frekvensen kan også vurderes, idet frekvensen varierer fra 5-6 Hz til 40 Hz, som anvendt i mange kroniske stimuleringsundersøgelser; det maksimale CBF-respons forekommer ved 10-20 Hz.

Dette er de første resultater af 13 eksperimenter, der vurderer både en tACS-stimulatorenhed med konstant strøm og en laserbilleddannelsesenhed med mus i to forskellige aldersgrupper (12-14 uger vs. 28-33 uger). Disse data fremhæver betydelige forbedringer i forhold til resultaterne vist af Turner et ^al.3. I kliniske prøver (dvs. mennesker) er den mulige feltstyrke meget lille (dvs. <0,2-0,5 mV/mm) på grund af hovedbundens nuværende begrænsninger og ubehag, mens 1-5 mV/mm hos gnavere typisk er blevet anslået til at være et aktivt, tolerabelt respons (figur 5).

Disse resultater omfatter de mere følsomme LSI CBF-responser (figur 5), herunder de forbigående CBF-responser på tACS. Figur 4 viser responsen på tACS ved brug af dobbelte intrakranielle elektroder til at måle det direkte hjernerespons (ved at måle elektriske feltgradienter) samt små og store CBF-responser. Vi eksperimenterer i øjeblikket med tACS med lav feltstyrke og sammenligner vores foretrukne musemodel af Alzheimers sygdom (CVN-AD model¹⁵) med kontroldyr.

Denne protokol fokuserer på in vivo, bedøvet måling af CBF-responsen som en biomarkør for at estimere hjernens respons på tES¹⁴. Langsigtede biomarkører for tES-responset inkluderer histologiske behandlingseffekter, såsom forebyggelse af eller ændringer i amyloid plaquedannelse (dvs. med gammastimulering ved 40 Hz i flere AD-modeller)^16,17,18,19, men kortsigtede biomarkører er også nyttige til at estimere de umiddelbare fysiologiske virkninger og beregne en dosis-responskurve ³. Den samme protokol kan også bruges til kronisk tES-stimulering over kraniet, men de stimulerende ledninger skal dirigeres til en bekvem, intermitterende forbindelse til vågen stimulering.

Det første kritiske trin inden for protokollen involverer opretholdelse af den lave impedans af de bilaterale stimulerende elektroder og måling af denne impedans med hver stimuleringsepoke. Den lave impedans kan opnås ved at bruge tilstrækkelig ledende pasta, isolering over kraniet og mineralolie til eventuelle burrhuller (for at forhindre alternative veje ind i kraniet). Vi har prøvet flere versioner af både kommercielle og hjemmelavede stimulerende elektroder, og den hjemmelavede tilgang giver mulighed for mere kontrol over impedansen. En konstantstrømsstimulatoranordning er afgørende for reproducerbarhed på tværs af elektroderne. Yderligere kritiske trin omfatter opretholdelse af DC-optagelserne med minimal drift over tid ved målte afstande i hjernen på en fast dybde for at estimere det intrakranielle felt i hjernebarken samt vurdering af cerebral blodgennemstrømning ved hjælp af enten laser Doppler-sonder eller laserspeckle-baseret billeddannelsessystem.

Til samtidig måling af den elektriske feltstyrke og intrakranielle elektriske felter har vi også tilføjet mikroelektrodeindsættelsesteknikken til laserspecklebilleddannelsesenheden ved hjælp af vinklede manipulatorer. Laserpletten giver mulighed for et mere omfattende overblik over hele kraniet, mens laserdopplersonderne er meget fokale og muligvis ikke giver repræsentative målinger, især direkte over et blodkar.

Selvom disse mere invasive eksperimenter udføres i bedøvede mus, er vores plan at udføre enten planlagt eller lukket kredsløb tACS i vågne dyr i den nedre ende af stimuleringsamplituden (dvs. 0,5-1,0 mA; 1-3 mV / mm feltstyrke). Selvom klinisk tES typisk er blevet udført med hudelektroder, er stimuleringsniveauet stærkt begrænset af hudbivirkninger og hovedpine til ~ 2 mA ⁴. De tilsvarende elektroder hos mennesker ville være subgaleale elektroder med mindre direkte hudstimulering.

Sammenlignet med at bruge hudmonterede elektroder er det lettere at demonstrere forbedringer hos slagtilfældepatienter, for eksempel ved hjælp af on-demand-stimulering med koordinerede implanterede vagusnervestimulerende elektroder og armaktivitet²⁰. Faktisk viser brugen af en eller anden form for implanteret elektrode konsistente og reproducerbare behandlingseffekter fra dag til dag; Derudover kan stimuleringen anvendes når som helst (dvs. ikke på planlagt basis, men i forhold til aktivitet), bivirkningerne kan reduceres, når de kan forudsiges eller induceres, og stimuleringen kan forlænges så længe som nødvendigt (dvs. måneder til år). Dette er f.eks. tilfældet for alle behandlinger med dyb hjernestimulering af Parkinsons sygdom, hvor langvarig implantation både er meget mulig og veltolereret²¹.

En anden mulighed for en implanteret kranieelektrode kunne være subgaleal stimulering (som vi udfører hos gnavere); Faktisk er dette blevet foreslået til langtidsovervågning af epilepsi^22,23. Subgaleal stimulering er mere fokuseret på kraniet og hjernen, kan eliminere mange bivirkninger af hudstimulering, kan tillade et bredere udvalg af strømme (og dermed intrakranielle elektriske feltstørrelser), der skal anvendes, er reproducerbar fra dag til dag (som enhver implanteret elektrode) og viser lav impedans (dvs. 500 Ω vs. 5-10 KΩ for hudelektroder). Med hensyn til kronisk tES-stimulering er der således flere tES-muligheder, der typisk implementeres hos gnavere, og klinisk kan det være kritisk vigtigt at have en testbar, fysiologisk biomarkør for at muliggøre længerevarende behandlingseffekter.