Визуализация кальция в Верхнем колликулусе мышей
Summary
В этом протоколе подробно описана процедура визуализации кальциевых ответов в верхнем бугорке (СК) бодрствующих мышей, включая визуализацию активности одного нейрона с помощью двухфотонной микроскопии с оставлением коры нетронутой у мышей дикого типа, а также визуализацию всей СК с помощью широкопольной микроскопии у мутантных мышей с частичной корой.
Abstract
Верхняя колликула (СК), эволюционно консервативная структура среднего мозга у всех позвоночных, является наиболее сложным зрительным центром до появления коры головного мозга. Он получает прямые входные данные от ~30 типов ганглиозных клеток сетчатки (RGC), каждый из которых кодирует определенную визуальную особенность. Остается неясным, наследует ли СК просто особенности сетчатки, или же в СК происходит дополнительная и потенциально de novo обработка. Чтобы выявить нейронное кодирование визуальной информации в СК, мы приводим здесь подробный протокол оптической регистрации зрительных реакций с помощью двух взаимодополняющих методов у бодрствующих мышей. Один метод использует двухфотонную микроскопию для визуализации активности кальция в разрешении одной клетки без абляции коры головного мозга, в то время как другой использует широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, кора головного мозга которой в значительной степени не развита. В этом протоколе подробно описаны эти два метода, включая подготовку животных, инъекцию вируса, имплантацию головной пластины, имплантацию пробки, сбор данных и анализ данных. Репрезентативные результаты показывают, что двухфотонная кальциевая визуализация выявляет визуально вызванные нейронные реакции при разрешении одной клетки, а широкопольная кальциевая визуализация показывает нейронную активность во всем СК. Комбинируя эти два метода, можно выявить нейронное кодирование в СК в разных масштабах, и такая комбинация может быть применена и к другим областям мозга.
Introduction
Верхний бугорок (СК) является важным зрительным центром у всех позвоночных. У млекопитающих он получает прямые входные сигналы от сетчатки и зрительной коры1. В то время как оптическая регистрация широко применяется в кореголовного мозга 2,3,4,5, ее применение в СК затруднено плохими оптическими доступами 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Целью данного протокола является предоставление подробной информации о двух взаимодополняющих методах оптической регистрации нейронной активности в СК.
СК располагается под корой головного мозга и поперечным синусом, что ограничивает оптический доступ к колликулярным нейронам. Один из подходов к преодолению этого ограничения заключается в аспирации коры головного мозга и обнажении передне-бокового SC 7,9,10,13,14,19. Однако, поскольку СК получает входные данные коры головного мозга, такая операция может повлиять на то, как нейроны СК реагируют на визуальные стимулы. Чтобы преодолеть это ограничение, мы подробно описали здесь альтернативный протокол визуализации поверхностного слоя заднемедиальной СК с помощью кремниевой пробки, оставляя кору нетронутой 8,11. В частности, для достижения одноклеточного разрешения мы применили двухфотонную микроскопию для получения изображений кальциевых ответов в заднемедиальном СК мышей дикого типа. Кроме того, чтобы добиться широкого охвата, мы применили широкопольную микроскопию для визуализации всей СК мутантной мыши, у которой задняя кора головного мозга не развилась20.
Два метода, описанные в этом протоколе, дополняют друг друга. Двухфотонная кальциевая визуализация без абляции коры головного мозга подходит для регистрации нейронной активности с разрешением одной клетки с интактными корковыми входами. Широкопольная кальциевая визуализация подходит для регистрации нейронной активности во всей СК при этом в ущерб пространственному разрешению.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в протоколе
Наиболее ответственным этапом является трепанация черепа на этапах 5.2 и 5.3. Во-первых, кость на 0,5 мм позади лямбды толстая и имеет кровеносные сосуды внутри, что может вызвать кровотечение в процессе сверления. Для остановки кровотечения следует ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (32271060). Ю.-Т.Л. спроектировал исследование, провел эксперимент, проанализировал данные и написал рукопись. З.Л. и Р.В. проводили эксперимент.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
