Summary

Kalzium-Bildgebung beim Colliculus superior der Maus

Published: April 21, 2023
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Bildgebung von Kalziumantworten im Colliculus superior (SC) von wachen Mäusen, einschließlich der Abbildung der Aktivität einzelner Neuronen mit Zwei-Photonen-Mikroskopie, während der Kortex bei Wildtyp-Mäusen intakt bleibt, und der Abbildung des gesamten SC mit Weitfeldmikroskopie bei Mäusen mit Teilkortex-Mutante.

Abstract

Der Colliculus superior (SC), eine evolutionär konservierte Mittelhirnstruktur bei allen Wirbeltieren, ist das am weitesten entwickelte Sehzentrum vor der Entstehung der Großhirnrinde. Es empfängt direkte Eingaben von ~30 Arten von retinalen Ganglienzellen (RGCs), von denen jede ein bestimmtes visuelles Merkmal kodiert. Es bleibt unklar, ob der SC einfach nur Netzhautmerkmale erbt oder ob eine zusätzliche und möglicherweise de novo Verarbeitung im SC stattfindet. Um die neuronale Kodierung visueller Informationen im SC aufzudecken, stellen wir hier ein detailliertes Protokoll zur optischen Aufzeichnung visueller Reaktionen mit zwei komplementären Methoden in wachen Mäusen zur Verfügung. Eine Methode verwendet Zwei-Photonen-Mikroskopie, um die Kalziumaktivität mit Einzelzellauflösung abzubilden, ohne den überlagernden Kortex abzutragen, während die andere Weitfeldmikroskopie verwendet, um die gesamte SC einer mutierten Maus abzubilden, deren Kortex weitgehend unentwickelt ist. In diesem Protokoll werden diese beiden Methoden detailliert beschrieben, einschließlich der Tierpräparation, der Virusinjektion, der Kopfplattenimplantation, der Plug-Implantation, der Datenerfassung und der Datenanalyse. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen, dass die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung visuell evozierte neuronale Reaktionen bei Einzelzellauflösung zeigt, und die Weitfeld-Kalzium-Bildgebung zeigt neuronale Aktivität über das gesamte SC. Durch die Kombination dieser beiden Methoden kann man die neuronale Kodierung im SC auf verschiedenen Skalen aufdecken, und eine solche Kombination kann auch auf andere Hirnregionen angewendet werden.

Introduction

Der Colliculus superior (SC) ist ein wichtiges Sehzentrum bei allen Wirbeltieren. Bei Säugetieren erhält es direkte Eingaben von der Netzhaut und dem visuellen Kortex1. Während die optische Aufzeichnung im Kortex 2,3,4,5 weit verbreitet ist, wird ihre Anwendung im SC durch schlechte optische Zugänge behindert 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Das Ziel dieses Protokolls ist es, Details über zwei komplementäre Methoden zur optischen Aufzeichnung der neuronalen Aktivität im SC bereitzustellen.

Der SC befindet sich unter dem Kortex und dem Sinus transversal, was den optischen Zugang zu den kollikulären Neuronen einschränkt. Ein Ansatz, um diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, den überlagernden Kortex zu aspirieren und den anterior-lateralen SCfreizulegen 7,9,10,13,14,19. Da der SC jedoch kortikale Inputs empfängt, kann eine solche Operation beeinflussen, wie die SC-Neuronen auf visuelle Reize reagieren. Um diese Einschränkung zu überwinden, beschreiben wir hier ein alternatives Protokoll, um die oberflächliche Schicht des posterior-medialen SC mit einem Silikonpfropfen abzubilden, während der Kortex intakt bleibt 8,11. Um eine Einzelzellauflösung zu erreichen, haben wir die Zwei-Photonen-Mikroskopie angewendet, um die Kalziumantwort im posterior-medialen SC von Wildtyp-Mäusen abzubilden. Um eine breite Abdeckung zu erreichen, haben wir außerdem Weitfeldmikroskopie angewendet, um das gesamte SC einer mutierten Maus abzubilden, deren hinterer Kortex sich nicht entwickelt hat20.

Die beiden in diesem Protokoll beschriebenen Methoden ergänzen einander. Die Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung ohne Ablation des Kortex eignet sich für die Aufzeichnung neuronaler Aktivität mit Einzelzellauflösung und intaktem kortikalem Input. Die Weitfeld-Kalzium-Bildgebung eignet sich für die Aufzeichnung der neuronalen Aktivität im gesamten SC unter Einbußen bei räumlicher Auflösung.

Protocol

Alle experimentellen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Tierschutzrichtlinien durchgeführt und von der IACUC am Chinesischen Institut für Hirnforschung, Peking, genehmigt. HINWEIS: Der Zeitplan für dieses Protokoll ist wie folgt: 1) Herstellung des Saugnapfes; 2) das Virus injizieren; 3) Implantieren Sie die Kopfplatte; 4) Implantieren Sie nach 3 Wochen den Pfropfen; 5) Führen Sie nach einer ~3-tägigen Erholung und Gewöhnung auf dem Laufband eine Zwei-Photonen-/Weitfeld-Bildgeb…

Representative Results

Die Abbildungen 1A,B zeigen, wie der Saugnapf bzw. die Stopfen hergestellt werden. Abbildung 2 zeigt, wie der Plug erfolgreich implantiert wird. Nach der Implantation des Plugs wird der posterior-mediale SC freigelegt, wie in Abbildung 2D dargestellt. Abbildung 3 zeigt die Kalziumantwort von SC-Neuronen an einer Wildtyp-Maus, die mit Zwei-Photonen-Mikroskopie aufgenommen wurde. Das drei…

Discussion

Kritische Schritte im Protokoll
Der kritischste Schritt ist die Kraniotomie in den Schritten 5.2 und 5.3. Erstens ist der Knochen 0,5 mm hinter dem Lambda dick und enthält Blutgefäße im Inneren, die während des Bohrvorgangs zu Blutungen führen können. Es sollte ein geeigneter Gelschaum vorbereitet werden, um die Blutung zu stoppen. Zweitens besteht eine gute Wahrscheinlichkeit für eine Angiorrhexis, wenn der Knochen direkt über der Sinus transversum entfernt wird. Zur Fehlerbehebung besteht ei…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird von der National Natural Science Foundation of China (32271060) unterstützt. Y.-t.L. entwarf die Forschung, führte das Experiment durch, analysierte die Daten und schrieb das Manuskript. Z.L. und R.W. führten das Experiment durch.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

Referências

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Citar este artigo
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

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