Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l’imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l’imaging dell’attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l’imaging dell’intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.
Abstract
Il collicolo superiore (SC), una struttura del mesencefalo evolutivamente conservata in tutti i vertebrati, è il centro visivo più sofisticato prima dell’emergere della corteccia cerebrale. Riceve input diretti da ~30 tipi di cellule gangliari retiniche (RGC), ognuna delle quali codifica una specifica caratteristica visiva. Rimane incerto se il SC erediti semplicemente le caratteristiche retiniche o se si verifichi un’elaborazione aggiuntiva e potenzialmente de novo nel SC. Per rivelare la codifica neurale delle informazioni visive nel SC, forniamo qui un protocollo dettagliato per registrare otticamente le risposte visive con due metodi complementari nei topi svegli. Un metodo utilizza la microscopia a due fotoni per visualizzare l’attività del calcio a una risoluzione a singola cellula senza ablare la corteccia sovrapposta, mentre l’altro utilizza la microscopia ad ampio campo per visualizzare l’intero SC di un topo mutante la cui corteccia è in gran parte non sviluppata. Questo protocollo descrive in dettaglio questi due metodi, tra cui la preparazione dell’animale, l’iniezione virale, l’impianto della placca testa, l’impianto del tappo, l’acquisizione dei dati e l’analisi dei dati. I risultati rappresentativi mostrano che l’imaging del calcio a due fotoni rivela risposte neuronali evocate visivamente a una risoluzione a singola cellula e l’imaging del calcio ad ampio campo rivela l’attività neurale in tutto il SC. Combinando questi due metodi, si può rivelare la codifica neurale nel SC su scale diverse, e tale combinazione può essere applicata anche ad altre regioni del cervello.
Introduction
Il collicolo superiore (SC) è un importante centro visivo in tutti i vertebrati. Nei mammiferi, riceve input diretti dalla retina e dalla corteccia visiva1. Mentre la registrazione ottica è stata ampiamente applicata alla corteccia 2,3,4,5, la sua applicazione nel SC è ostacolata da scarsi accessi ottici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire dettagli su due metodi complementari per la registrazione ottica dell’attività neurale nel SC.
L’SC si trova sotto la corteccia e il seno trasverso, il che limita l’accesso ottico ai neuroni collicolari. Un approccio per superare questa limitazione è quello di aspirare la corteccia sovrapposta ed esporre il SC antero-laterale 7,9,10,13,14,19. Tuttavia, poiché il SC riceve input corticali, tale operazione potrebbe influenzare il modo in cui i neuroni SC rispondono agli stimoli visivi. Per ovviare a questa limitazione, descriviamo qui un protocollo alternativo per visualizzare lo strato superficiale del SC posteriore-mediale con un tappo di silicio, lasciando intatta la corteccia 8,11. In particolare, per ottenere una risoluzione a singola cellula, abbiamo applicato la microscopia a due fotoni per visualizzare le risposte del calcio nel SC posteriore-mediale di topi wild-type. Inoltre, per ottenere un’ampia copertura, abbiamo applicato la microscopia ad ampio campo per visualizzare l’intero SC di un topo mutante la cui corteccia posteriore non si è sviluppata20.
I due metodi descritti in questo protocollo sono complementari l’uno all’altro. L’imaging del calcio a due fotoni senza ablazione della corteccia è appropriato per registrare l’attività neurale a risoluzione di una singola cellula con input corticali intatti. L’imaging del calcio ad ampio campo è appropriato per registrare l’attività neurale nell’intero SC sacrificando la risoluzione spaziale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici del protocollo
La fase più critica è la craniotomia nelle fasi 5.2 e 5.3. Innanzitutto, l’osso a 0,5 mm dietro la lambda è spesso e ha vasi sanguigni all’interno, che possono causare sanguinamento durante il processo di perforazione. Deve essere preparata un’adeguata schiuma di gel per fermare l’emorragia. In secondo luogo, c’è una buona probabilità di angioressi quando si rimuove l’osso appena sopra il seno trasverso. Per la risoluzione dei problemi, un approccio alternativo con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. progettò la ricerca, eseguì l’esperimento, analizzò i dati e scrisse il manoscritto. Z.L. e R.W. eseguirono l’esperimento.
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
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