माउस सुपीरियर कोलिकुलस में कैल्शियम इमेजिंग
Summary
यह प्रोटोकॉल जागृत चूहों के बेहतर कोलिकुलस (एससी) में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं की इमेजिंग की प्रक्रिया का विवरण देता है, जिसमें जंगली-प्रकार के चूहों में कॉर्टेक्स को बरकरार रखते हुए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एकल-न्यूरॉन गतिविधि की इमेजिंग और आंशिक-कॉर्टेक्स उत्परिवर्ती चूहों में वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी के साथ पूरे एससी की इमेजिंग शामिल है।
Abstract
सुपीरियर कोलिकुलस (एससी), सभी कशेरुकियों में एक विकासवादी रूप से संरक्षित मिडब्रेन संरचना, सेरेब्रल कॉर्टेक्स के उद्भव से पहले सबसे परिष्कृत दृश्य केंद्र है। यह ~ 30 प्रकार के रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) से प्रत्यक्ष इनपुट प्राप्त करता है, जिसमें प्रत्येक एक विशिष्ट दृश्य सुविधा को एन्कोडिंग करता है। यह अभी भी अस्पष्ट है कि क्या एससी को रेटिना विशेषताएं विरासत में मिलती हैं या क्या एससी में अतिरिक्त और संभावित रूप से नए सिरे से प्रसंस्करण होता है। एससी में दृश्य जानकारी के तंत्रिका कोडिंग को प्रकट करने के लिए, हम यहां जागृत चूहों में दो पूरक तरीकों के साथ दृश्य प्रतिक्रियाओं को ऑप्टिकल रूप से रिकॉर्ड करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। एक विधि दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकल-कोशिका रिज़ॉल्यूशन पर कैल्शियम गतिविधि को चित्रित करने के लिए ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को हटा देती है, जबकि दूसरी एक उत्परिवर्ती माउस के पूरे एससी को चित्रित करने के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करती है जिसका कॉर्टेक्स काफी हद तक अविकसित है। यह प्रोटोकॉल इन दो तरीकों का विवरण देता है, जिसमें पशु तैयारी, वायरल इंजेक्शन, हेडप्लेट आरोपण, प्लग आरोपण, डेटा अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल हैं। प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है कि दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर नेत्रहीन न्यूरोनल प्रतिक्रियाओं को प्रकट करती है, और वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग पूरे एससी में तंत्रिका गतिविधि को प्रकट करती है। इन दो विधियों के संयोजन से, कोई भी एससी में तंत्रिका कोडिंग को विभिन्न पैमानों पर प्रकट कर सकता है, और इस तरह के संयोजन को अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों पर भी लागू किया जा सकता है।
Introduction
सुपीरियर कोलिकुलस (एससी) सभी कशेरुकियों में एक महत्वपूर्ण दृश्य केंद्र है। स्तनधारियों में, यह रेटिना और दृश्य कॉर्टेक्स1 से सीधे इनपुट प्राप्त करता है। जबकि ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग को कॉर्टेक्स 2,3,4,5 पर व्यापक रूप से लागू किया गया है, एससी में इसका आवेदन खराब ऑप्टिकल एक्सेस 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 से बाधित है।, 18,19. इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एससी में तंत्रिका गतिविधि की ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए दो पूरक तरीकों के बारे में विवरण प्रदान करना है।
एससी कॉर्टेक्स और ट्रांसवर्स साइनस के नीचे स्थित है, जो कोलिकुलर न्यूरॉन्स तक ऑप्टिकल पहुंच को सीमित करता है। इस सीमा को दूर करने का एक तरीका ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को हटाना और पूर्वकाल-पार्श्व एससी 7,9,10,13,14,19 को उजागर करना है। हालांकि, क्योंकि एससी कॉर्टिकल इनपुट प्राप्त करता है, इस तरह का ऑपरेशन प्रभावित कर सकता है कि एससी न्यूरॉन्स दृश्य उत्तेजनाओं का जवाब कैसे देते हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, हम यहां एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का विस्तार करते हैं जो एक सिलिकॉन प्लग के साथ पश्च-औसत दर्जे के एससी की सतही परत को चित्रित करता है, जबकि कॉर्टेक्सको बरकरार रखता है। विशेष रूप से, एकल-कोशिका संकल्प प्राप्त करने के लिए, हमने जंगली-प्रकार के चूहों के पश्च-उपचारात्मक एससी में कैल्शियम प्रतिक्रियाओं को चित्रित करने के लिए दो-फोटॉन माइक्रोस्कोपी लागू की। इसके अलावा, व्यापक कवरेज प्राप्त करने के लिए, हमने एक उत्परिवर्ती माउस के पूरे एससी की छवि के लिए वाइड-फील्ड माइक्रोस्कोपी लागू की, जिसका पिछला कॉर्टेक्स20 विकसित नहीं हुआ है।
इस प्रोटोकॉल में वर्णित दो विधियां एक दूसरे के पूरक हैं। कॉर्टेक्स को अलग किए बिना दो-फोटॉन कैल्शियम इमेजिंग बरकरार कॉर्टिकल इनपुट के साथ एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त है। वाइड-फील्ड कैल्शियम इमेजिंग स्थानिक संकल्प का त्याग करते हुए पूरे एससी में तंत्रिका गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए उपयुक्त है।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम
सबसे महत्वपूर्ण कदम चरण 5.2 और 5.3 में क्रैनियोटॉमी है। सबसे पहले, लैम्ब्डा के पीछे 0.5 मिमी की हड्डी मोटी होती है और अंदर रक्त वाहिकाएं होती हैं, जिससे ड्रिलिंग प्रक्रि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (32271060) द्वारा समर्थित है। वाई-टीएल ने अनुसंधान को डिजाइन किया, प्रयोग किया, डेटा का विश्लेषण किया, और पांडुलिपि लिखी। जेडएल और आरडब्ल्यू ने प्रयोग किया।
Materials
| 16x objective | Nikon | ||
| 50-mm lens | Computar | M5018-MP2 | |
| 5-mm coverslip | Warner instruments | CS-5R | |
| bandpass filter | Chroma Technology | HQ575/250 m-2p | |
| butyl cyanoacrylate | Vetbond, World Precision Instruments | ||
| camera for monitoring pupil | FLIR | BFS-U3-04S2M-CS | |
| camera for widefield imaging | Basler | acA2000-165µm | |
| corona treater | Electro-Technic Products | BD-20AC | |
| dichroic | Chroma Technology | T600/200dcrb | |
| galvanometers | Cambridge Technology | ||
| glass bead sterilizer | RWD | RS1502 | |
| microdrill | RWD | 78001 | |
| micromanipulator | Sutter Instruments | QUAD | |
| photomultiplier tube | Hamamatsu | R3896 | |
| rotory encoder | USdigital | MA3-A10-125-N | |
| self-curing dental adhesive resin cement | SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan | ||
| thermostatic heating pad | RWD | 69020 | |
| Ti:Sapphire laser | Spectra-Physics | Mai Tai HP DeepSee | |
| translucent silicone adhesive | Kwik-Sil, World Precision Instruments | ||
| treadmill | Xinglin Biology | ||
| Virus Strains | |||
| rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m | Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Animals | |||
| C57BL/6J wild type | Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing | ||
| Emx1-Cre | The Jackson Laboratory | 5628 | |
| Pals1flox/wt | Christopher A. Walsh Lab | ||
| Software | |||
| ImageJ | NIH Image | ||
| Labview | National Instruments | ||
| MATLAB | Mathworks |
Referências
- May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
- Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
- de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
- Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
- Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
- Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
- Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
- de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
- Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
- Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
- Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
- Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
- Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
- Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
- Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
- Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
- Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
- Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
- Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
- Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).
