Summary

Kalciumavbildning hos mus Superior Colliculus

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Detta protokoll beskriver proceduren för avbildning av kalciumsvar i den överlägsna colliculus (SC) hos vakna möss, inklusive avbildning av enneuronaktivitet med tvåfotonmikroskopi samtidigt som cortex lämnas intakt i vildtypsmöss, och avbildning av hela SC med vidfältsmikroskopi i partiella cortexmutanta möss.

Abstract

Superior colliculus (SC), en evolutionärt bevarad mitthjärnstruktur hos alla ryggradsdjur, är det mest sofistikerade syncentret före uppkomsten av hjärnbarken. Den tar emot direkta indata från ~30 typer av retinala ganglieceller (RGC), där var och en kodar för en specifik visuell funktion. Det är fortfarande svårt att avgöra om SC helt enkelt ärver näthinnefunktioner eller om ytterligare och potentiellt ny bearbetning sker i SC. För att avslöja den neurala kodningen av visuell information i SC tillhandahåller vi här ett detaljerat protokoll för att optiskt registrera visuella svar med två kompletterande metoder i vakna möss. Den ena metoden använder tvåfotonmikroskopi för att avbilda kalciumaktivitet med encellsupplösning utan att ablera den överliggande cortex, medan den andra använder vidvinkelmikroskopi för att avbilda hela SC hos en muterad mus vars cortex i stort sett är outvecklad. Detta protokoll beskriver dessa två metoder, inklusive djurförberedelser, virusinjektion, implantation av huvudplattan, pluggimplantation, datainsamling och dataanalys. De representativa resultaten visar att tvåfotonkalciumavbildningen avslöjar visuellt framkallade neuronala svar vid encellsupplösning, och den vidfältskalciumavbildningen avslöjar neural aktivitet över hela SC. Genom att kombinera dessa två metoder kan man avslöja den neurala kodningen i SC på olika skalor, och en sådan kombination kan också tillämpas på andra hjärnregioner.

Introduction

Superior colliculus (SC) är ett viktigt syncentrum hos alla ryggradsdjur. Hos däggdjur får den direkta intryck från näthinnan och synbarken1. Medan optisk inspelning har tillämpats i stor utsträckning på cortex 2,3,4,5, hindras dess tillämpning i SC av dålig optisk åtkomst 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. Målet med detta protokoll är att ge detaljer om två kompletterande metoder för optisk registrering av den neurala aktiviteten i SC.

SC är belägen under cortex och tvärgående sinus, vilket begränsar optisk åtkomst till kollikulära neuroner. Ett tillvägagångssätt för att övervinna denna begränsning är att aspirera den överliggande cortex och exponera den främre-laterala SC 7,9,10,13,14,19. Men eftersom SC tar emot kortikala ingångar kan en sådan operation påverka hur SC-neuronerna svarar på visuella stimuli. För att övervinna denna begränsning beskriver vi här ett alternativt protokoll för att avbilda det ytliga lagret av den posterior-mediala SC med en kiselplugg, samtidigt som cortex lämnas intakt 8,11. Specifikt, för att uppnå encellsupplösning, tillämpade vi tvåfotonmikroskopi för att avbilda kalciumsvar i den posteriora-mediala SC hos vildtypsmöss. Dessutom, för att uppnå bred täckning, tillämpade vi vidvinkelmikroskopi för att avbilda hela SC av en muterad mus vars bakre cortex inte har utvecklat20.

De två metoder som beskrivs i detta protokoll kompletterar varandra. Kalciumavbildningen med två fotoner utan att ablera cortex är lämplig för att registrera neural aktivitet med encellsupplösning med intakta kortikala ingångar. Kalciumavbildningen med brett fält är lämplig för att registrera neural aktivitet i hela SC samtidigt som den rumsliga upplösningen offras.

Protocol

Alla experimentella procedurer utfördes i enlighet med djurskyddsriktlinjerna och godkändes av IACUC vid Chinese Institute for Brain Research, Peking. OBS: Tidslinjen för detta protokoll är som följer: 1) gör sugkoppen; 2) injicera viruset; 3) implantera huvudplattan; 4) efter 3 veckor, implantera pluggen; 5) Efter en ~3 dagars återhämtning och tillvänjning på löpbandet, utför två-foton/vidvinkelavbildning. 1. Beredning av en sugkopp (<st…

Representative Results

Figurerna 1A,B visar hur man tillverkar sugkoppen respektive pluggarna. Figur 2 visar hur man implanterar pluggen framgångsrikt. Efter implantation av pluggen exponeras den posteriora mediala SC, som visas i figur 2D. Figur 3 visar kalciumrespons från SC-neuroner från ett exempel på vildtypsmus avbildad med tvåfotonmikroskopi. Det triangulära prismat, som lätt fångas under mikro…

Discussion

Kritiska steg i protokollet
Det mest kritiska steget är kraniotomin i steg 5.2 och 5.3. För det första är benet 0,5 mm bakom lambdan tjockt och har blodkärl inuti, vilket kan orsaka blödning under borrningsprocessen. Tillräckligt med gelskum bör förberedas för att stoppa blödningen. För det andra finns det en god risk för angiorrhexis när man tar bort benet strax ovanför den tvärgående sinusen. För felsökning är ett alternativt tillvägagångssätt att tunna ut benet inuti ovalen o…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. utformade forskningen, utförde experimentet, analyserade data och skrev manuskriptet. Z.L. och R.W. utförde experimentet.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

Referências

  1. May, P. J. The mammalian superior colliculus: laminar structure and connections. Progress in Brain Research. 151, 321-378 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  3. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433 (7026), 597-603 (2005).
  4. Ratzlaff, E. H., Grinvald, A. A tandem-lens epifluorescence macroscope: Hundred-fold brightness advantage for wide-field imaging. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 127-137 (1991).
  5. de Vries, S. E. J., et al. A large-scale standardized physiological survey reveals functional organization of the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 23 (1), 138-151 (2020).
  6. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Altered map of visual space in the superior colliculus of mice lacking early retinal waves. The Journal of Neuroscience. 25 (29), 6921-6928 (2005).
  7. Cang, J., Wang, L., Stryker, M. P., Feldheim, D. A. Roles of ephrin-as and structured activity in the development of functional maps in the superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 28 (43), 11015-11023 (2008).
  8. Feinberg, E. H., Meister, M. Orientation columns in the mouse superior colliculus. Nature. 519 (7542), 229-232 (2015).
  9. Ahmadlou, M., Heimel, J. A. Preference for concentric orientations in the mouse superior colliculus. Nature Communications. 6, 6773 (2015).
  10. de Malmazet, D., Kühn, N. K., Farrow, K. Retinotopic separation of nasal and temporal motion selectivity in the mouse superior colliculus. Current Biology. 28 (18), 2961-2969 (2018).
  11. Li, Y. T., Turan, Z., Meister, M. Functional architecture of motion direction in the mouse superior colliculus. Current Biology. 30 (17), 3304-3315 (2020).
  12. Gribizis, A., et al. Visual cortex gains independence from peripheral drive before eye opening. Neuron. 104 (4), 711-723 (2019).
  13. Inayat, S., et al. Neurons in the most superficial lamina of the mouse superior colliculus are highly selective for stimulus direction. The Journal of Neuroscience. 35 (20), 7992-8003 (2015).
  14. Barchini, J., Shi, X., Chen, H., Cang, J. Bidirectional encoding of motion contrast in the mouse superior colliculus. eLife. 7, 35261 (2018).
  15. Savier, E. L., Chen, H., Cang, J. Effects of locomotion on visual responses in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 39 (47), 9360-9368 (2019).
  16. Schröder, S., et al. Arousal modulates retinal output. Neuron. 107 (3), 487-495 (2020).
  17. Ge, X., et al. Retinal waves prime visual motion detection by simulating future optic flow. Science. 373 (6553), (2021).
  18. Chen, H., Savier, E. L., DePiero, V. J., Cang, J. Lack of evidence for stereotypical direction columns in the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 41 (3), 461-473 (2021).
  19. Kasai, M., Isa, T. Effects of light isoflurane anesthesia on organization of direction and orientation selectivity in the superficial layer of the mouse superior colliculus. The Journal of Neuroscience. 42 (4), 619-630 (2022).
  20. Kim, S., et al. The apical complex couples cell fate and cell survival to cerebral cortical development. Neuron. 66 (1), 69-84 (2010).
  21. Kaifosh, P., Zaremba, J. D., Danielson, N. B., Losonczy, A. S. I. M. A. Python software for analysis of dynamic fluorescence imaging data. Frontiers in Neuroinformatics. 8, 80 (2014).
  22. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  23. Kerlin, A. M., Andermann, M. L., Berezovskii, V. K., Reid, R. C. Broadly tuned response properties of diverse inhibitory neuron subtypes in mouse visual cortex. Neuron. 67 (5), 858-871 (2010).
  24. Göbel, W., Helmchen, F. In vivo calcium imaging of neural network function. Physiology. 22 (6), 358-365 (2007).
  25. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  26. Evans, D. A., et al. A synaptic threshold mechanism for computing escape decisions. Nature. 558 (7711), 590-594 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

View Video