Une technique simple pour doser l’activité locomotrice chez la drosophile

Drosophila melanogaster fournit un excellent organisme modèle pour étudier les fonctions cellulaires et moléculaires dans les modèles de maladies neuronales créés par la modification du gène¹, le traitement médicamenteux² et la sénescence³. La conservation élevée des voies biologiques, des propriétés physiques et des gènes homologues associés aux maladies entre les humains et la drosophile fait de la mouche des fruits un imitateur idéal du niveau moléculaire au niveau comportemental⁴. Dans de nombreux modèles de maladies, la déficience comportementale est un indice important, fournissant un modèle utile pour diverses neuropathies humaines ^5,6. La drosophile est maintenant utilisée pour étudier de multiples maladies humaines, le développement neurologique et les maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique ^7,8. La détection de la capacité motrice des modèles de maladie est cruciale pour comprendre le progrès pathogène et peut fournir une corrélation phénotypique avec les mécanismes moléculaires sous-jacents au processus de la maladie.

Récemment, des outils logiciels disponibles dans le commerce et des programmes rentables ont été développés pour les stratégies de détection locomotrice de la drosophile, telles que les tests à haut débit chez les mouches groupées^9,10 et la mesure de la locomotion en temps réel^11,12. L’une de ces approches conventionnelles est la géotaxie négative interactive rapide (RING), également appelée test d’escalade, qui comprend plusieurs canaux permettant de contenir une grande population de mouches du même sexe et du même âge, réduisant ainsi la variation tout en collectant ^9,13 données. Une autre méthode de pré-test pour analyser le comportement locomoteur est TriKinetics Drosophila activity monitor (DAM), un dispositif qui utilise plusieurs faisceaux pour détecter le mouvement de l’activité des mouches dans un mince tube^{de verre 14}. L’appareil enregistre la position en continu, ce qui représente la locomotion automatisée en calculant les croisements de faisceaux pour étudier l’activité et le rythme circadien des mouches sur une plus longue période de temps¹⁵. Bien que ces méthodes aient été largement utilisées dans l’analyse des défauts de comportement chez les mouches des fruits pour déterminer les changements dans la locomotion comportementale, elles nécessitent toujours un équipement de test spécial ou des processus d’analyse complexes, et limitent leur application dans certains modèles avec un dispositif simple et limité. Les stratégies de dépistage des animaux basées sur des groupes pour tester la drosophile adulte, telles que FlyGrAM¹¹ et le test de l’île de la drosophile ¹⁰, mettent en œuvre le recrutement social et le suivi individuel dans une zone prédéfinie. Néanmoins, la restriction sociale individuelle dans les zones défiées pourrait avoir un effet négatif sur les identifications dans les images, causée par la collision ou le chevauchement des mouches. Même si certaines méthodes open source basées sur des matériaux, telles que TRex¹⁶, MARGO¹² et FlyPi¹⁷, ont une urgence, elles peuvent accélérer le traçage des mouches avec une utilisation flexible dans les tests comportementaux. Ces approches de test sont associées à des installations d’appareils expérimentaux élaborés, à des exigences logicielles spéciales ou à des langages informatiques professionnels. Pour les larves, la mesure de la distance totale parcourue à travers le nombre de lignes de bordure de la grille par unité de temps¹⁸, ou le comptage approximatif des contractions de la paroi corporelle pour les individus manuellement¹⁹, sont les méthodes prédominantes pour évaluer leur capacité locomotrice. En raison du manque de précision de l’équipement ou des dispositifs et des méthodes d’analyse, une partie de la locomotion comportementale des larves peut échapper à la détection, ce qui rend difficile l’évaluation précise du mouvement comportemental, en particulier le mouvement fin¹⁵.

La présente méthode développée utilise l’interface de programmation d’application (API) AnimalTracker , compatible avec le programme de traitement d’images Fidji (ImageJ), pour évaluer systématiquement l’activité locomotrice des mouches adultes et larvaires en analysant leur comportement de suivi à partir de vidéos haute définition (HD). Fiji est une distribution logicielle open source ImageJ qui peut combiner des bibliothèques logicielles robustes avec de nombreux langages de script, ce qui entraîne un prototypage rapide des algorithmes de traitement d’images, ce qui le rend populaire parmi les biologistes pour ses capacités d’analyse d’images²⁰. Dans l’approche actuelle, l’intégration de Fiji dans l’API AnimalTracker est exploitée pour développer un test comportemental unique sur la drosophile avec insertion d’algorithmes personnalisés, et fournit une étape utile pour une documentation détaillée et des tutoriels afin de soutenir des capacités analytiques robustes du comportement locomoteur (Figure 1). Pour contourner la complication des identifications objectives dans les images causées par la collision ou le chevauchement des mouches, chaque arène est limitée à accueillir une seule mouche. Après avoir évalué la précision du suivi de l’approche, elle a été mise en œuvre pour tracer et quantifier les mouvements locomoteurs de la drosophile qui ont été administrés avec le médicament toxique roténone, qui est généralement utilisé pour les modèles animaux de la maladie de Parkinson, découvrant finalement une altération de la locomotion dans le traitement médicamenteux²¹. Cette méthodologie, qui utilise des logiciels libres et open source, ne nécessite pas d’instrumentation coûteuse et peut analyser avec précision et reproductibilité la locomotion comportementale de la drosophile .

W¹¹¹⁸ mouches adultes et larves du troisième stade ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation expérimentale

REMARQUE: Une arène en plein champ pour le suivi de la locomotion de la drosophile est fabriquée avec un gel de silice incolore et inodore.

1. Mélanger le réactif A et le réactif B dans un rapport de 1:10, conformément aux instructions du fabricant pour le kit de silice (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que le bicarbonate de sodium est ajouté au mélange en remuant jusqu’à ce que la couleur passe au blanc. Transférer le mélange dans une boîte de Petri propre et le placer dans un four à 40 °C pour le séchage pendant 48 h.
2. Réglez la caméra HD (voir Tableau des matériaux) sur un trépied, en l’ajustant de manière à ce que l’objectif de la caméra soit perpendiculaire à la surface de l’arène de silice. En ajustant la distance focale et les ouvertures de la caméra, assurez-vous que la caméra est mise au point sur la surface de la silice et que l’écran est correctement éclairé. La configuration expérimentale est illustrée à la figure 1.
3. Transférez une mouche dans l’arène en plein champ pour enregistrer une vidéo continue d’au moins 61 s.
   REMARQUE: Compte tenu de la nature léthargique des larves, un temps d’enregistrement vidéo de plus de 10 minutes est recommandé.
   1. Ouvrez la vidéo avec Fidji, faites glisser la barre de progression jusqu’à l’image initiale et approuvez tacitement. Choisissez le corps entier de la mouche à l’aide de l’outil « sélection à main levée » (Figure 2B,C).
   2. Cliquez sur l’image > réglez > luminosité et contraste pour régler la balance des blancs jusqu’à ce que la valeur de gris de la zone sélectionnée se rapproche de l’arrière-plan général (Figure 2D-F).
      REMARQUE: L’homogénéisation de l’arrière-plan de la première image permet au logiciel de distinguer l’arrière-plan sans aucun objet et de créer un contraste lorsqu’une mouche est présente, permettant ainsi au logiciel de le suivre.
4. Effectuez l’expérience entière dans un environnement d’essai réglé à 25 °C et 60 % d’humidité relative, dans un endroit calme et dépourvu d’exposition à la lumière vive.

2. Enregistrement vidéo et prétraitement

1. Après une courte période d’anesthésie utilisant 95% de dioxyde de carbone (CO₂), transférez une mouche dans l’arène ouverte et appuyez sur le bouton d’enregistrement de l’application de la caméra pour démarrer l’enregistrement vidéo.
   REMARQUE: Pour minimiser l’effet de l’anesthésique sur la locomotion, laissez les mouches récupérer pendant 10 minutes avant de commencer l’enregistrement vidéo. L’anesthésie à froid par refroidissement est également recommandée.
   1. Une fois que les mouches se sont remises de l’anesthésie, placez le plat de l’arène contenant la mouche sous la caméra et secouez rapidement la plaque d’un côté à l’autre pour vous assurer que la mouche est en mouvement lorsque l’enregistrement commence.
2. Une fois l’enregistrement terminé, appuyez sur le bouton d’arrêt pour mettre fin à l’enregistrement vidéo.
   REMARQUE: Assurez-vous que le temps d’enregistrement vidéo dépasse légèrement le temps de suivi de destination par une petite marge. De plus, pour améliorer l’efficacité expérimentale, il est possible de suivre plusieurs mouches spontanément. Cela dépend de la résolution de la caméra pour permettre un recadrage vidéo de haute qualité.
3. Convertissez les vidéos enregistrées au format AVI avec encodage MJPEG, afin qu’elles puissent être ouvertes et analysées à l’aide de Fidji. Pendant ce temps, réglez le taux d’images par seconde (fps) de la vidéo à 15 ips pour les mouches adultes et à 12 ips pour les larves.

3. Analyse vidéo

1. Ouvrez la vidéo qui a été transformée avec « utiliser la pile virtuelle » et « convertir en niveaux de gris », deux options dans la fenêtre contextuelle lors de l’ouverture de la vidéo avec Fidji (Figure 2A).
2. Créez une première image vierge, comme mentionné ci-dessus.
3. Obtenez une fenêtre de traitement à l’aide de l’outil « définir l’image active » du plugin AnimalTracker et créez une zone de suivi qui entoure l’arène dans la fenêtre vidéo d’origine à l’aide de l’outil « ovale » (Figure 3A).
4. Définissez les filtres (Figure 3A,3) et les paramètres des deux filtres (Figure 4A-G) pour la première image vierge de la fenêtre de traitement. Sélectionnez ensuite l’image suivante dans la fenêtre vidéo d’origine et choisissez la surface filtrée de la fenêtre de traitement (Figure 5A-C).
   REMARQUE: L’étape de filtrage sert à diminuer le bruit de l’image et / ou à supprimer l’arrière-plan, ce qui simplifie la séparation du premier plan de l’arrière-plan dans la binarisation des images.
5. Une fois qu’une fenêtre de traitement filtrée est sélectionnée, tournez la mouche suivie avec un profil rouge couvert dans la fenêtre de traitement à l’aide de l’outil « définir le seuil » (Figure 3A, 4, Figure 5D-E et Figure 6A).
6. Utilisez le détecteur de blob défini pour permettre à l’ordinateur de reconnaître la mouche dont le profil rouge est couvert dans la fenêtre de traitement (Figure 3A,5 et Figure 6B).
7. Définissez l’image 901 comme dernière image pour la mouche adulte, calculée par la durée d’enregistrement et les images par seconde de la vidéo (Figure 3A, 6, Figure 6C).
   REMARQUE: L’expérience suivante avec des larves a été suivie pendant 10 minutes, donc l’image 7200 est définie comme dernière image.
8. Utilisez l’outil « Afficher les objets blob » pour présenter un rectangle de suivi dans la fenêtre vidéo d’origine (Figure 3A,7 et Figure 6D,E). Ensuite, démarrez le suivi et exportez le fichier de suivi une fois la surveillance terminée (Figure 3A,8,9 et Figure 7A,B).

4. Analyse des fichiers de suivi

1. Chargez les fichiers de suivi et de zone à l’aide du plug-in Animal tracker > Tracking analyzer (Figure 8A).
2. Sélectionnez l’index souhaité à l’aide des paramètres de zone et modifiez les paramètres (Figure 8). Calculez la durée de l’intervalle d’images à l’aide de la fréquence d’images.
   REMARQUE : dans cette condition, la fréquence d’images est de 15 ips et l’intervalle d’images est d’environ 0,067 s, ce qui est le paramètre par défaut (Figure 8D).
3. Produisez les graphiques d’analyse quantitative à l’aide du tableur et de GraphPad Prism après les avoir analysés dans l’analyseur de suivi (Figure 9).

5. Analyse par base de sondage

1. Effectuez une analyse de vitesse par intervalle d’image. Analysez le fichier de suivi sans Fidji si des recherches plus détaillées sont nécessaires.
   1. Ouvrez le fichier de suivi, copiez toutes les coordonnées dans Microsoft Office Excel et divisez les cellules à l’aide de la touche espace.
      Remarque : Par exemple, une fois que le fichier a été divisé en colonnes « C » et « D », la vitesse de la drosophile par intervalle d’image est calculée par la formule SQRT((C5-C4)^2+(D5-D4)^2), qui est indiquée dans la colonne « E » (Figure 10A). Les données de la colonne « E » indiquent le nombre de pixels que la mouche a déplacés entre deux images, la première image n’étant pas prise en compte. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un graphique linéaire pour afficher une vitesse de déplacement intuitive de la mouche par intervalle d’image, avec un pic sur le graphique linéaire (Figure 10B).
2. Calculez le temps d’immobilité par intervalle d’image. Une fois le fichier divisé en colonnes « C » et « D », calculez l’état d’immobilité de la drosophile par intervalle d’image en utilisant la formule IF(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2) <20, 0, 1), qui est affichée dans la colonne « E ». (figure 10C).
   REMARQUE: Contrairement à l’analyse de vitesse, les résultats de la première image ont été définis. Les mouches qui se déplaçaient à moins de 20 pixels étaient considérées comme immobiles et enregistrées comme « 0 » dans la colonne « E ».
   1. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un histogramme pour afficher visuellement le temps d’immobilité par la marge de l’ensemble du graphique à colonnes (Figure 10D).
3. Assurez-vous que l’angle de direction change.
   NOTE: L’analyse de l’angle de changement de direction représente le choix de direction des mouches. Une fois le fichier divisé en colonnes « C » et « D », l’angle de changement de direction est calculé par la formule ACOS(((SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2))^2+(SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))^2-(SQRT((C7-C5)^2+(D7-D5)^2))^2)/(2*SQRT((C6-C5)^2+(D6-D5)^2))*( SQRT((C7-C6)^2+(D7-D6)^2)))*180/PI(), qui est présentée dans la colonne « E » (Figure 10E). Les résultats calculés indiquent l’angle entre trois coordonnées.
   1. Sélectionnez tous les résultats calculés et insérez un diagramme de dispersion pour illustrer l’angle de changement de direction du mouvement des mouches (Figure 10F).

Dans la présente étude, les déficits locomoteurs chez les mouches adultes et les larves du troisième stade traitées à la roténone ont été examinés et comparés dans leur activité motrice à celle d’une mouche témoin nourrie avec le solvant diméthylsulfoxyde (DMSO). Il a été démontré que le traitement par roténone chez la drosophile provoque une perte de neurones dopaminergiques dans le cerveau²² et entraîne des déficits locomoteurs importants²³. Comme le montrent les figures 11 et 12, les mouches adultes et les larves du troisième stade traitées à la roténone présentent des déficits locomoteurs importants par rapport à ceux des mouches témoins nourries au DMSO. La figure 11 et la figure 12B-E illustrent les changements relatifs de la distance, de la vitesse et du temps d’immobilité des paramètres de déplacement entre les mouches traitées avec ou sans roténone. La figure 11 et la figure 12F-K illustrent une analyse représentative des paramètres de vitesse, de temps d’immobilité et de sélection de la direction, avec ou sans traitement à la roténone chez les adultes et les larves. L’analyse quantitative des paramètres de distance, de temps d’immobilité et de vitesse à l’aide du logiciel fidjien chez les mouches adultes (Figure 11) et les larves du troisième stade (Figure 12) des groupes d’alimentation en médicaments confirme en outre que le traitement par roténone peut être utilisé pour étudier les déficits locomoteurs dans les maladies humaines, y compris les maladies neurodégénératives, et reproduire certaines des caractéristiques comportementales observées chez les humains et les mammifères.

Figure 1 : Organigramme décrivant la configuration de l’équipement et la procédure expérimentale pour l’analyse du suivi des mouvements de la drosophile. L’arène de suivi locomoteur est imagée avec une caméra HD aérienne qui est incorporée et contrôlée par un ordinateur. La procédure d’analyse de la locomotion de la drosophile comprend l’enregistrement vidéo, le suivi des mouvements, l’analyse des fichiers de suivi, le traitement des données et l’analyse paramétrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Homogénéisation de l’arrière-plan de la première image. (A) Cochez l’option « convertir en niveaux de gris » lors de l’ouverture de la vidéo transformée, pour transformer la vidéo en niveaux de gris et éviter les interférences de couleur. (B) Décrire la drosophile à l’aide de l’outil de sélection à main levée, indiqué dans l’encadré rouge. (C) Lors de la sélection de l’analyse, une ligne jaune a été utilisée pour délimiter les contours des mouches. Garder la ligne jaune près des contours de la mouche réduit la probabilité de sélectionner une région qui n’est pas occupée par la mouche. Barre d’échelle = 1 cm. (D) Ajustez la luminosité et le contraste de la première image jusqu’à ce que la zone encadrée en jaune devienne la même échelle de gris que l’arrière-plan. (E) Terminez le réglage de la luminosité et du contraste pour la première image, mais pas pour toutes les images, en cliquant sur « Non » dans la fenêtre « pile ». (F) En fin de compte, le premier cadre est ajusté pour créer un arrière-plan uniforme et sans tache. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Paramètres de la fenêtre de suivi et de la zone de suivi. (A) Terminez l’analyse de suivi en cliquant sur les plug-ins de suivi dans l’ordre indiqué dans la fenêtre de suivi des animaux. (B) Après avoir défini l’image active dans la figure A, 1, une fenêtre de traitement qui affiche uniquement le cadre actuel est présentée. La fenêtre vidéo principale et la fenêtre de traitement sont clairement distinguées et sont utilisées dans des situations différentes. Pour modifier l’image actuelle, assurez-vous que la modification est exécutée dans la fenêtre vidéo principale ; La modification sera visible dans les deux fenêtres. Barre d’échelle = 1 cm. (C) Créez une zone de suivi qui entoure l’arène, en utilisant l’outil « ovale » pour la reconnaissance informatique. La sélection de la zone de suivi doit se faire dans une arène encerclée dans une fenêtre vidéo ouverte, plutôt que dans une fenêtre de traitement. (D) Délimiter une zone de poursuite avec les lignes jaunes pour s’adapter le plus possible à l’arène, afin de minimiser la perturbation de la lumière extérieure. Barre d’échelle = 1 cm. (E) Pour définir la région d’intérêt (ROI) dans la zone de suivi, cliquez sur les boutons suivant l’ordre marqué avec les numéros affichés dans la fenêtre « concepteur de zone ». Dans cette étape, l’ensemble de l’opération doit être terminé après l’ouverture de la fenêtre vidéo choisie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Réglage du filtre pour la première image. (A) En terminant le réglage du retour sur investissement pour la zone de suivi, la ligne jaune entourant l’arène devient verte dans la fenêtre vidéo ouverte et la fenêtre de traitement. Barre d’échelle = 1 cm. (B) L’ajout de l’objectif des filtres définit un arrière-plan noir pour rendre l’objet cible plus évident pour la première image de la fenêtre de traitement. L’ensemble de l’opération doit être effectué dans une fenêtre de traitement, plutôt que dans une fenêtre vidéo ouverte. (C, D) L’ajout des filtres « sous-tracteur d’arrière-plan » et « Flou gaussien » à la fenêtre « Paramètres de filtre » rend la première image de la fenêtre de traitement noire. L’ensemble du processus de réglage du filtre doit être terminé dans la première image. (E) Les paramètres sont définis étape par étape en cliquant sur des boutons marqués d’un numéro et d’un rectangle rouge dans la fenêtre « sous-tracteur d’arrière-plan ». L’étape « définir l’image » doit être utilisée une fois la fenêtre de traitement sélectionnée. (F) Barre d’échelle = 1 cm. La fenêtre « image médiane » sera présentée après avoir cliqué sur le bouton « afficher le filtre » dans « E4 » et fermé directement la fenêtre sans aucune opération. (G) Le paramètre du flou gaussien est défini avec une valeur sigma par défaut de 2,0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Paramètres de seuil de la deuxième image. (A) En cliquant sur la barre de progression inférieure, faites avancer la fenêtre vidéo vers la deuxième image. La mouche réapparaît au milieu de l’écran et est identifiée par Fidji. Barre d’échelle = 1 cm. (B,C) Affichez la fenêtre de traitement avant et après le filtrage. (B) Affichez la fenêtre de traitement filtrée en sélectionnant le mode marqué d’un rectangle rouge. (C) Exemple de fenêtre de traitement avec un rectangle rouge après la sélection du mode « filtré ». Barre d’échelle = 1 cm. (D) Définissez le seuil en sélectionnant la méthode de seuil par défaut, « seuil en niveaux de gris », illustrée dans la fenêtre « seuilleurs », après avoir choisi l’outil « définir le seuil » de la figure 3A,4. (E) Ajustez les paramètres en faisant glisser la boîte de la barre de progression au milieu jusqu’à ce que la mouche de suivi soit vue et couverte par le profil rouge. Il n’est pas recommandé de modifier les paramètres par défaut pour les paramètres encadrés dans le rectangle rouge ci-dessous. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Détecteur d’objets blob, réglage de la dernière image et sélection du suivi des animaux. (A) Lorsqu’elle atteint le seuil indiqué à la figure 5E, la fenêtre de traitement révèle un profil rouge important suivant la mouche dans la deuxième image. Adaptez le profil rouge recouvrant la mouche au suivi de la mouche. Barre d’échelle = 1 cm. (B) Définissez la mouche recouverte d’un profil rouge comme cible pour le suivi en sélectionnant la méthode de détection de blob par défaut, « détecteur de blob de base ». (C) Définir l’image 901 comme dernière image à l’aide de l’outil « définir la dernière image » de la figure 3A,6. Le nombre total d’images est calculé par la formule « nombre d’images = fps * temps d’enregistrement ». (D) Le suivi vole avec un rectangle jaune encadré après les taches de spectacle dans la fenêtre vidéo ouverte (section du panneau de gauche). Dans le panneau gauche agrandi, les mouches des fruits sont attachées en rouge (section du panneau de droite). Barre d’échelle = 1 cm. (E) La mouche de suivi avec un rectangle rouge encadré après avoir cliqué pour sélectionner le rectangle rouge dans « D » (section du panneau supérieur). Dans l’agrandissement du panneau supérieur, les mouches des fruits sont attachées en rouge (section du panneau inférieur). Assurez-vous que la sélection d’un rectangle jaune autour d’une mouche de suivi est terminée dans la fenêtre vidéo ouverte. Terminez la sélection dans la fenêtre vidéo ouverte et la mouche sera identifiée par les Fidji dans toutes les images. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Résultats du suivi du suivi. La trace de suivi est affichée séparément dans la fenêtre vidéo ouverte (A) et la fenêtre de traitement (B). Pour obtenir le profil de suivi de la trace, cliquez sur la barre de progression dans la fenêtre vidéo d’origine et faites glisser la barre de progression pour vérifier la continuité de la trace. La trace de suivi présente intuitivement la distance de rampement des mouches. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8: Analyse de fichiers de suivi à l’aide des plugins AnimalTracker. A) L’analyseur de suivi facilite l’analyse détaillée du fichier de suivi; Chaque étape marquée d’un rectangle rouge est représentée par un nombre. (B) Définir les paramètres de « paramètres de zone » dans A,4. Quatre paramètres, le temps, la distance, le temps d’immobilité et le vecteur vitesse, sont représentés dans le rectangle rouge. Le paramètre est sélectionné en fonction du résultat souhaité. (C-G) Définissez les paramètres de configuration individuellement dans la fenêtre « définir les paramètres » de A,5. (C) Quatre paramètres réglables sont illustrés dans la fenêtre « paramètres de configuration », (D-G) affichant respectivement les fenêtres « réglages de temps », « réglage du temps d’immobilité », « paramètres de distance » et « réglage du vecteur vitesse », respectivement. Il n’est pas recommandé de modifier la valeur par défaut des paramètres de paramètre. Cependant, pour « l’intervalle d’images », le paramètre doit être calculé à l’aide de la formule « intervalle d’images = 1/fps » lorsque le fps de la vidéo est modifié. En outre, il est possible d’utiliser une échelle connue pour déterminer la distance et la vitesse réelles en corrélant les pixels enregistrés avec le suivi d’une mouche à une valeur tangible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9 : Résultat affichant l’analyse du fichier de suivi. (A) Le réglage de la figure 8A,6. Deux modes d’affichage des données sont disponibles : « groupé par zones » et « groupé par paramètres ». B) Les résultats de l’analyse du dossier de suivi sont présentés comme « regroupés par zones » dans « A,6.1 ». (C-F) Les résultats de l’analyse des fichiers de suivi sont présentés comme « regroupés par paramètres » dans A,6.2, présentant « temps d’immobilité » (C), « vecteur vitesse » (D), « temps » (E) et « distance » (F) séparément. Les résultats du temps et de la distance d’immobilité sont quantifiés en « s » et en « pixels ». L’unité du vecteur vitesse doit être définie comme « pixel/s » et sortie avec l’annotation « longueur ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10 : Résultats de l’analyse des données pour la vitesse par fps. (A, C et E) Les données d’exportation contiennent les coordonnées des pixels dans les partitions horizontales (colonne « C ») et verticales (colonne « D »), ainsi que le mouvement des pixels, l’immobilité et l’angle de changement de direction entre les intervalles de deux images (colonne « E » dans A, C et E respectivement), qui est automatiquement calculé par la formule décrite dans le contexte. Comme les résultats exportés de Fidji sont des documents texte, il est recommandé d’ouvrir le fichier avec Microsoft Office Excel et de diviser les données en trois colonnes en ajoutant des espaces entre elles. (B, D et F) Un graphique linéaire affiche les résultats calculés à partir de l’ensemble de données du mouvement des pixels (B). La valeur de crête globale représente la vitesse, indicative des capacités de détection de mouvement; l’histogramme affiche les résultats calculés à partir de l’ensemble de données de l’immobilité (D). Le degré de parcimonie dans le graphique à colonnes représente l’immobilité, qui présente le défaut de capacité motrice des mouches; un diagramme de dispersion affiche les résultats calculés à partir de l’ensemble de données de l’angle de changement de direction (F). L’enrichissement des éclaboussures illustré dans le diagramme de dispersion représente la direction choisie par la mouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11 : Analyse comparative des déplacements entre mouches traitées avec ou sans roténone. (A) Des graphiques représentatifs de la trace de suivi des mouches adultes W¹¹¹⁸ nourries avec des aliments standard contenant 500 μM de roténone, ou DMSO pour le contrôle, sont présentés. W¹¹¹⁸ mouches ont été collectées puis placées dans un environnement contrôlé composé d’aliments standard contenant 500 μM de roténone ou de DMSO, 25 ° C et 60% d’humidité. Six mouches ont été utilisées pour l’analyse de chaque groupe après 48 h. Le résultat révèle que la distance de mouvement des mouches de suivi alimentées à la roténone est considérablement réduite par rapport à celle du témoin. Le résultat a montré une capacité motrice défectueuse chez les mouches nourries à la roténone. (B-E) L’analyse quantitative du traitement à la roténone sur la distance moyenne parcourue, le temps d’immobilité, la vitesse moyenne et la vitesse maximale est effectuée à Fidji. Les résultats du traitement à la roténone ont montré une diminution significative de la distance parcourue et de la vitesse moyenne, ainsi qu’une augmentation significative du temps d’immobilité. (F-K) Analyse des pixels par image (F, G), du temps d’immobilité par image (H, I) et des changements d’angle de direction (J, K) entre les mouches traitées à la roténone (G, I, K) ou au DMSO (F, H, J). Des exemples de graphiques illustrant les effets de la roténone sur la vitesse de déplacement montrent moins de pics représentant la vitesse de déplacement par intervalle d’image chez les mouches nourries à la roténone (G) par rapport à celles du témoin (F), indiquant la gravité du défaut d’activité locomotrice (F, G). La colonne d’immobilité intuitionniste de pixels déplacés par image est plus basse, montrant beaucoup moins de mouvement en 1 min pour les mouches nourries par roténone (I) par rapport aux mouches témoins (H). Des exemples de graphiques de l’angle de déplacement des changements de direction chez les animaux roténone-nourris (K) et témoins (J) révèlent des modifications dans la direction choisie par les mouches. Les données sont la moyenne ± MEB de six mouches mâles surveillées pendant 1 min. Les astérisques indiquent des différences significatives entre les groupes (***p < 0,001; test t non apparié, p = 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 12 : Analyse comparative du mouvement entre les larves traitées avec ou sans roténone. (A) Résultats représentatifs de la comparaison de l’activité locomotrice par traçage de la trace de larves W¹¹¹⁸ du troisième stade nourries avec de la roténone ou du DMSO. En bref, les larves du troisième stade W¹¹¹⁸ ont été collectées et cultivées dans 10% de saccharose, ou 10% de saccharose contenant 500 μM de roténone, dans un environnement à 25 ° C avec 60% d’humidité. Six larves par groupe ont été utilisées pour l’analyse. Compte tenu de la lenteur du mouvement des larves, l’enregistrement des données sur une période de 5 minutes a été quantifié et analysé pour évaluer les effets de la roténone sur la locomotion. (B-E) La distance moyenne, le temps d’immobilité, la vitesse moyenne et la vitesse maximale des deux groupes analysés aux Fidji sont analysés quantitativement. Les résultats quantitatifs montrent que la distance de déplacement, la vitesse moyenne et la vitesse maximale diminuent significativement chez les larves nourries à la roténone, et le temps d’immobilité augmente significativement chez les larves nourries à la roténone. (F-K) Comme pour les mouches adultes, l’analyse des pixels par image, du temps d’immobilité et des changements d’angle de direction entre les mouches traitées avec de la roténone (G, I, K) et sans roténone (F, H, J) a montré que les larves traitées avec de la roténone avaient une vitesse de déplacement plus faible, plus de temps d’immobilité et alternaient leurs directions. Les résultats révèlent que le mouvement comportemental des larves de suivi nourries avec de la roténone est significativement altéré par rapport au contrôle. Les résultats montrent une activité locomotrice défectueuse des mouches nourries à la roténone. Les données sont la moyenne ± MEB de six larves âgées de 3 jours surveillées pendant 5 minutes. Les astérisques indiquent une différence significative entre les groupes (*p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; test t non apparié, p = 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Comparaison des méthodologies basées sur le suivi des animaux pour la quantification de l’activité locomotrice chez la drosophile. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Nous avons conçu une méthode, basée sur le matériel open source AnimalTracker API compatible avec le programme de traitement d’images des Fidji, qui peut permettre aux chercheurs d’évaluer systématiquement l’activité locomotrice en suivant les mouches larvaires adultes et individuelles. AnimalTracke est un outil écrit en Java qui peut être facilement intégré dans des bases de données existantes ou d’autres outils pour faciliter l’analyse du comportement de suivi des animaux conçu par application²⁴. Lors d’une analyse image par image par une formule de calcul logicielle qui quantifie l’activité locomotrice des adultes et des larves, plusieurs paramètres, notamment la vitesse de déplacement, la distance parcourue, l’immobilité et les changements d’angle de direction, peuvent être analysés de manière flexible. Ces paramètres, qui représentent différents aspects de la locomotion comportementale, peuvent être tracés pour illustrer les changements locomoteurs au fil du temps. De plus, en créant une interface utilisateur graphique, une documentation détaillée sur son utilisation et une interface de programmation d’application, nous visons à rendre cette méthode accessible aux chercheurs qui manquent d’expérience en programmation et aux utilisateurs expérimentés qui créent des paradigmes expérimentaux personnalisés.

Pour vérifier que la méthode peut surveiller avec précision le comportement, des tests locomoteurs sur des mouches adultes et des larves traitées à la roténone, ainsi qu’une comparaison de leur activité motrice à celle des mouches témoins nourries avec le solvant du médicament, ont été effectués. Le logiciel Fidji, avec ses plugins, est utilisé pour analyser les coordonnées en pixels de chaque image dans l’enregistrement vidéo du mouvement, permettant de calculer la vitesse, la distance et d’autres paramètres des mouches expérimentales. Nous avons observé une diminution significative de la distance parcourue au fil du temps dans l’administration de roténone (Figure 11), ce qui est cohérent avec les résultats rapportés²³. Pendant ce temps, la vitesse de mouvement ascendante et la direction anormale choisie ont été observées dans des groupes nourris avec de la drogue, pour aider à illustrer plus de détails sur la déficience comportementale chez les mouches. Compte tenu du succès de la détection de l’activité locomotrice des mouches adultes, nous avons ensuite cherché à évaluer la mobilité des larves (Figure 12). Par rapport au témoin, les résultats du suivi des larves nourries à la roténone étaient significativement altérés, parallèlement à ceux des mouches adultes nourries avec des médicaments. Des expériences avec des adultes et des larves nourris à la roténone suggèrent que cette méthode peut enregistrer avec précision la réduction des mouches qui ont produit des déficits locomoteurs par rapport aux témoins. Ce rapport a démontré avec succès les applications de la méthode actuelle pour quantifier et analyser la capacité locomotrice et d’autres facettes des défauts de comportement des mouches des fruits dans des modèles de test ou de recherche pharmacologique chez les animaux.

Pour s’assurer que l’analyse vidéo et de suivi donne des résultats réussis et reproductibles, il est recommandé de respecter les directives suivantes. Tout d’abord, pour le choix de la fréquence d’images vidéo, nous vous recommandons de convertir la vidéo enregistrée dans un format de 15 images par seconde (ips). Cela peut non seulement maintenir un bon suivi de mouvement, mais aussi éviter la lenteur de l’analyse informatique causée par de grandes quantités de données. En améliorant la fréquence d’images vidéo, l’analyse de la trajectoire de mouvement devient plus détaillée. Deuxièmement, les paramètres de la formule peuvent également être ajustés en fonction du schéma expérimental correspondant lors de l’analyse du mouvement statique entre deux images. Pour la surveillance locomotrice des larves, il est essentiel d’utiliser du gel de silice plutôt que de l’agar-agar, car le gel de silice solidifié est serré et les larves ne peuvent pas y pénétrer. De plus, le gel de silice est transparent et peut être teint en ajoutant de la substance de couleur pour produire un arrière-plan optimal, facilitant les effets optiques souhaités qui améliorent la qualité de l’image.

Les systèmes de suivi des animaux sont en cours de développement pour fournir des solutions complètes aux communautés de l’étiologie, des neurosciences et de la génétique comportementale. Le tableau 1 présente une comparaison des caractéristiques de plusieurs programmes de suivi actuellement disponibles 10,11,12,16,17,25,26. Cette approche est extrêmement rentable, simple à apprendre et précise dans la mesure du comportement locomoteur, sans nécessiter de logiciels et d’équipements coûteux. Il ne fait aucun doute que cette méthode peut être facilement étendue à d’autres modèles animaux de type drosophile, et même à des animaux plus gros tels que les rats et les souris. La structure de l’API AnimalTracker peut être étendue facilement grâce à des applications ou des plug-ins ImageJ indépendants, offrant un large éventail de boîtes à outils utiles pour la recherche et l’analyse comportementales personnalisées²⁴. Néanmoins, cette étude comporte certaines restrictions. Étant donné qu’une seule mouche est placée dans une arène en plein champ pour l’enregistrement d’images et que le suivi vidéo est effectué individuellement, cette méthode est inefficace et prend beaucoup de temps. Nous avons tenté d’augmenter la capacité d’enregistrement simultané de plusieurs arènes, permettant jusqu’à six enregistrements individuels. Il est théoriquement possible d’enregistrer un plus grand nombre de drosophiles simultanément; Cela dépend de la taille de l’arène et de la configuration de la caméra. Par ailleurs, si les utilisateurs souhaitent étendre à l’enregistrement de drosophiles groupées, il est recommandé de tenir compte du nombre limité d’enregistrements uniques et d’une configuration de qualité suffisante pour identifier les collisions et les chevauchements entre les mouches. Les améliorations de l’efficacité des tests par l’apprentissage automatique n’ont pas été prises en compte dans l’étude, car aucune approche abordable et compatible n’a été trouvée qui puisse être intégrée au système actuel pour distinguer visuellement les identités et suivre les modèles avec précision.

En résumé, la méthode décrite ici développe et valide une approche efficace et simple basée sur un logiciel libre et open-source, conçue pour réduire la consommation de temps et affiner les techniques expérimentales d’indication et d’analyse quantitatives de la locomotion de la drosophile aux stades larvaire et adulte. Grâce à une analyse systématique, cette méthode peut nous aider à comprendre comment la vitesse de l’animal change au fil du temps pendant le mouvement, ainsi que les caractéristiques de la sélection directionnelle. Ainsi, l’incorporation de logiciels open source dans les appareils numériques couramment utilisés fournit un moyen fiable de tester l’activité locomotrice dans divers modèles de mouches. Cela pourrait être utile pour évaluer les résultats locomoteurs physiologiques et pathologiques en testant des modèles de maladies neurodégénératives dérivés du traitement pharmacologique et de la modification transgénique chez la drosophile ainsi que chez d’autres animaux.