Forberedelse av 3D decellulariserte matriser fra musens skjelettmus for cellekultur

Den ekstracellulære matrisen (ECM) er en viktig bestanddel av vev, som representerer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensjonale (3D) strukturen gir ikke bare fysisk støtte til celler, men spiller også en avgjørende rolle i de biokjemiske prosessene som er involvert i utviklingen av organismer¹. Dannelsen av en vevsspesifikk ECM skjer under utvikling, som et resultat av de komplekse interaksjonene mellom celler og deres nisjer, påvirket av ulike intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en svært dynamisk struktur som gjennomgår kjemiske og mekaniske omorganiseringer på en temporal-romlig måte og direkte påvirker celleskjebne². En av de mest bemerkelsesverdige egenskapene til ECM er dens funksjonelle mangfold, da hvert vev ECM viser en unik kombinasjon av molekyler som gir forskjellige topologier og egenskaper som er skreddersydd for cellene den inneholder¹.

ECM-signalering og støtte er avgjørende for utvikling og homeostase, og når det forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstander ^3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfull medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den vanligste formen for medfødt muskeldystrofi. LAMA2-genet koder for laminin α2-kjeden, som er tilstede i laminin 211 og laminin 221, og når mutert kan føre til LAMA2-CMD⁵. Laminin 211 er den viktigste isoformen som finnes i kjellermembranen som omgir skjelettmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, blir koblingen mellom kjellermembranen og muskelcellene forstyrret, noe som fører til sykdomsutbruddet⁶. Pasienter med LAMA2-CMD viser en mild til alvorlig fenotype avhengig av type mutasjon i LAMA2-genet.

Når funksjonen til laminin α2-proteinet påvirkes, kan pasienter oppleve alvorlig muskelhypotoni ved fødselen og utvikle kronisk betennelse, fibrose og muskelatrofi, noe som fører til redusert forventet levealder. Til dags dato har ingen målrettede behandlinger blitt utviklet, og terapeutiske tilnærminger er begrenset til å lindre symptomene på sykdommen⁷. Derfor er forståelse av de underliggende molekylære mekanismene som er involvert i utbruddet av denne sykdommen avgjørende for å utvikle hensiktsmessige terapeutiske strategier ^6,8. Tidligere arbeid med dy^{W-mus 9}, en modell for LAMA2-CMD, antyder at sykdomsutbruddet starter i utero, spesielt under fostermyogenese¹⁰. En bedre forståelse av hvordan fostermyogenesedefekten oppstår, ville være en spillveksler i å generere nye terapeutiske tilnærminger for LAMA2-CMD.

In vitro-systemer gir et kontrollert miljø for å studere celle-celle- og celle-ECM-interaksjoner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten til innfødte vev. Decellularisering av vev produserer vevs- og utviklingsstadiespesifikke acellulære ECM-stillaser som mer nøyaktig etterligner det naturlige cellemikromiljøet sammenlignet med 2D-modeller og konstruerte/syntetiske stillas. Decellulariserte matriser (dECM) har potensial til å bevare de molekylære og mekaniske signalene til vertsvevet, noe som gjør dem til bedre alternative modeller for forståelse in vivo-prosesser ¹¹.

Det finnes ulike teknikker, reagenser og forhold som kan brukes til decellularisering^12,13. I denne studien er en decellulariseringsprotokoll for fostermushjertet, beskrevet av Silva et al.14,15, tilpasset fostermusens skjelettmus og funnet å beholde alle testede ECM-komponenter (laminin α2, totale lamininer, fibronektin^, kollagen I og kollagen IV). Protokollen inneholder tre trinn: cellelyse ved osmotisk sjokk (hypoton buffer), plasmamembranoppløsning og proteindissosiasjon (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]), og enzymatisk ødeleggelse av DNA (DNase-behandling). Så vidt vi vet, er dette den første etablerte protokollen for decellularisering av mus føtal skjelettmuskulatur.

For å bruke dette 3D in vitro-systemet til å studere LAMA2-CMD, er det avgjørende å opprettholde laminin α2-kjeden etter decellularisering. Derfor ble det implementert en optimaliseringsprotokoll der forskjellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og konsentrasjoner (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) ble testet (data ikke vist). Det optimale valget for cellefjerning og konservering av laminin α2-proteinet ble funnet å være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletablert myoblastcellelinje^16,17, ble brukt til å frø dECM. Disse cellene invaderer dECM, sprer seg og differensierer inne i disse stillasene, og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produksjonen av denne 3D in vitro-modellen gir en ny tilnærming til å forstå molekylære og cellulære prosesser involvert i fostermyogenese, utbruddet av LAMA2-CMD, og kan utvides til andre muskelsykdommer der kommunikasjonen mellom ECM og skjelettmuskelceller forstyrres.