胎儿小鼠骨骼肌3D脱细胞基质的制备用于细胞培养

细胞外基质（ECM）是组织的主要成分，代表其非细胞成分。这种三维（3D）结构不仅为细胞提供物理支持，而且在生物体发育所涉及的生化过程中起着至关重要^{的作用1。}组织特异性ECM的形成发生在发育过程中，这是细胞与其壁龛之间复杂相互作用的结果，受到各种细胞内和细胞外刺激的影响。ECM是一种高度动态的结构，以时空方式经历化学和机械重排，直接影响细胞命运²。ECM最显着的特征之一是其功能多样性，因为每个组织ECM都显示出独特的分子组合，这些分子提供了针对^其所含细胞量身定制的不同拓扑结构和特性1。

ECM信号传导和支持对于发育和体内平衡至关重要，当中断时可导致多种病理状况^3，4。一个例子是LAMA2缺陷性先天性营养不良症（LAMA2-CMD），这是先天性肌营养不良症最常见的形式。LAMA2基因编码层粘连蛋白α2链，该链存在于层粘连蛋白211和层粘连蛋白221中，当突变时可导致 LAMA2-CMD ⁵。层粘连蛋白211是在骨骼肌纤维周围的基底膜中发现的主要亚型。当层粘连蛋白211异常或不存在时，基底膜和肌肉细胞之间的联系被破坏，导致疾病的发作⁶。LAMA2-CMD患者表现出轻度至重度表型，具体取决于 LAMA2 基因突变的类型。

当层粘连蛋白α2蛋白的功能受到影响时，患者在出生时会出现严重的肌肉张力减退，并发生慢性炎症、纤维化和肌肉萎缩，导致预期寿命缩短。迄今为止，尚未开发出有针对性的治疗方法，治疗方法仅限于缓解疾病的症状⁷。因此，了解参与这种疾病发作的潜在分子机制对于制定适当的治疗策略至关重要^6，8。先前使用LAMA2-CMD模型dy ^W小鼠⁹的工作表明，该疾病的发作始于子宫内，特别是在胎儿肌发生期间¹⁰。更好地了解胎儿肌生成缺陷是如何出现的，将是为LAMA2-CMD产生新治疗方法的游戏规则改变者。

体外 系统为研究细胞-细胞和细胞-ECM相互作用提供了受控环境，但2D培养模型缺乏天然组织的复杂性。组织的去细胞化产生组织和发育阶段特异性无细胞ECM支架，与2D模型和工程/合成支架相比，它更准确地模拟天然细胞微环境。脱细胞基质（dECM）有可能保留宿主组织的分子和机械线索，使其成为理解 体内 过程的更好替代模型¹¹。

有多种技术、试剂和条件可用于脱细胞^12，13。在这项研究中，由Silva等人描述的胎鼠心脏脱细胞方案¹⁴，¹⁵适用于胎鼠骨骼肌，并发现保留所有测试的ECM成分（层粘连蛋白α2，总层粘连蛋白，纤连蛋白^，胶原蛋白I和胶原蛋白IV）。该方案包括三个步骤：渗透休克细胞裂解（低渗缓冲液），质膜溶解和蛋白质解离（0.05%十二烷基硫酸钠[SDS]）和DNA的酶促破坏（DNase处理）。据我们所知，这是第一个建立的小鼠胎儿骨骼肌去细胞化的方案。

为了使用该3D体外系统研究LAMA2-CMD，在脱细胞后维持层粘连蛋白α2链至关重要。因此，实施了优化方案，其中测试了不同的洗涤剂（SDS和Triton X-100）和浓度（0.02%，0.05%，0.1%，0.2%和0.5%）（数据未显示）。细胞去除和保存层粘连蛋白α2蛋白的最佳选择是0.05%SDS。C2C12细胞是一种成熟的肌母细胞系¹⁶，^17，用于接种dECM。这些细胞侵入dECM，在这些支架内增殖和分化，合成新的ECM蛋白。这种3D体外模型的成功生产提供了一种新方法来理解胎儿肌生成，LAMA2-CMD的发作所涉及的分子和细胞过程，并且可以扩展到ECM和骨骼肌细胞之间的通信被破坏的其他肌肉疾病。