Fremstilling af 3D decellulariserede matricer fra føtal mus skeletmuskulatur til cellekultur

Den ekstracellulære matrix (ECM) er en vigtig bestanddel af væv, der repræsenterer deres ikke-cellulære komponent. Denne tredimensionelle (3D) struktur giver ikke kun fysisk støtte til celler, men spiller også en afgørende rolle i de biokemiske processer, der er involveret i udviklingen af organismer¹. Dannelsen af en vævsspecifik ECM forekommer under udvikling som et resultat af de komplekse interaktioner mellem celler og deres nicher, påvirket af forskellige intra- og ekstracellulære stimuli. ECM er en meget dynamisk struktur, der gennemgår kemiske og mekaniske omlejringer på en tidsmæssig-rumlig måde og direkte påvirker celleskæbne². Et af de mest bemærkelsesværdige kendetegn ved ECM er dets funktionelle mangfoldighed, da hver vævs-ECM viser en unik kombination af molekyler, der giver forskellige topologier og egenskaber, der er skræddersyet til de celler, den indeholder¹.

ECM-signalering og støtte er afgørende for udvikling og homeostase, og når de forstyrres, kan det føre til flere patologiske tilstande ^3,4. Et eksempel er LAMA2-mangelfuld medfødt dystrofi (LAMA2-CMD), som er den mest almindelige form for medfødt muskelsvind. LAMA2-genet koder for laminin α2-kæden, som er til stede i laminin 211 og laminin 221, og når det muteres, kan det føre til LAMA2-CMD⁵. Laminin 211 er den vigtigste isoform, der findes i kældermembranen, der omgiver skeletmuskelfibre. Når laminin 211 er unormal eller fraværende, forstyrres forbindelsen mellem kældermembranen og muskelcellerne, hvilket fører til sygdommens begyndelse⁶. Patienter med LAMA2-CMD viser en mild til svær fænotype afhængigt af typen af mutation i LAMA2-genet.

Når funktionen af laminin α2-proteinet påvirkes, kan patienterne opleve alvorlig muskelhypotoni ved fødslen og udvikle kronisk inflammation, fibrose og muskelatrofi, hvilket fører til en reduceret forventet levetid. Til dato er der ikke udviklet målrettede behandlinger, og terapeutiske tilgange er begrænset til at lindre symptomerne på sygdommen⁷. Derfor er forståelse af de underliggende molekylære mekanismer, der er involveret i begyndelsen af denne sygdom, afgørende for at udvikle passende terapeutiske strategier ^6,8. Tidligere arbejde ved hjælp af dy^{W-musen 9}, en model for LAMA2-CMD, tyder på, at sygdommens begyndelse starter i utero, specifikt under føtal myogenese¹⁰. En bedre forståelse af, hvordan fostrets myogenesedefekt opstår, ville være en spilskifter i generering af nye terapeutiske tilgange til LAMA2-CMD.

In vitro-systemer giver et kontrolleret miljø til undersøgelse af celle-celle- og celle-ECM-interaktioner, men 2D-kulturmodeller mangler kompleksiteten af indfødte væv. Decellularisering af væv producerer vævs- og udviklingsfasespecifikke acellulære ECM-stilladser, der mere præcist efterligner det naturlige cellemikromiljø sammenlignet med 2D-modeller og konstruerede / syntetiske stilladser. Decellulariserede matricer (dECM’er) har potentialet til at bevare værtsvævets molekylære og mekaniske signaler, hvilket gør dem til bedre alternative modeller til forståelse af in vivo-processer ¹¹.

Der er forskellige teknikker, reagenser og betingelser, der kan bruges til decellularisering^12,13. I denne undersøgelse er en decellulariseringsprotokol for føtal musehjerte, beskrevet af Silva et al.14,15, tilpasset føtal museskeletmuskulatur og fundet at bevare alle testede ECM-komponenter (laminin α2, total lamininer, fibronectin^, kollagen I og kollagen IV). Protokollen omfatter tre trin: cellelyse ved osmotisk shock (hypotonisk buffer), plasmamembranopløsning og proteindissociation (0,05% natriumdodecylsulfat [SDS]) og enzymatisk ødelæggelse af DNA (DNase-behandling). Så vidt vi ved, er dette den første etablerede protokol til decellularisering af museføtal skeletmuskulatur.

For at bruge dette 3D in vitro-system til undersøgelse af LAMA2-CMD er det afgørende at opretholde laminin α2-kæden efter decellularisering. Derfor blev der implementeret en optimeringsprotokol, hvor forskellige vaskemidler (SDS og Triton X-100) og koncentrationer (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% og 0,5%) blev testet (data ikke vist). Det optimale valg til cellefjernelse og konservering af laminin α2-proteinet viste sig at være 0,05% SDS. C2C12-celler, en veletableret myoblastcellelinje^16,17, blev brugt til at frø dECM’erne. Disse celler invaderer dECM, formerer sig og differentierer sig inde i disse stilladser og syntetiserer nye ECM-proteiner. Den vellykkede produktion af denne 3D in vitro-model tilbyder en ny tilgang til forståelse af de molekylære og cellulære processer, der er involveret i føtal myogenese, begyndelsen af LAMA2-CMD, og kan udvides til andre muskelsygdomme, hvor kommunikationen mellem ECM og skeletmuskelceller forstyrres.