Antilichaamopnametest voor het volgen van notch / delta-endocytose tijdens de asymmetrische deling van radiale glia-voorlopers van zebravissen

Notch-signalering controleert de beslissing over het lot van cellen en patronen tijdens de ontwikkeling in metazoën¹, en recente studies hebben aangetoond dat Notch-signalering bij stamceldeling voornamelijk afhankelijk is van endocytische handel ^2,3. Endocytosed Notch/Delta kan Notch-signalering in de kern activeren en de transcriptie van Notch-doelgenen ^4,5,6 verbeteren. Directionele Notch/Delta endosomale handel werd voor het eerst waargenomen in Drosophila sensory organ precursor (SOP) cellen tijdens de asymmetrische celdeling (ACD), wat resulteerde in een hogere Notch signaleringsactiviteit in pIIa dan in pIIb ^7,8. Antilichaamopnametests met anti-Delta- en anti-Notch-antilichamen zijn toegepast om het endocytische proces in mitotische SOP-cellen te controleren. Inkeping/DeltaD-endosomen bewegen samen met een kinesinemotoreiwit naar de centrale spil tijdens cytokinese en worden asymmetrisch getransloceerd in de pIIa-cel als gevolg van de antiparallel array van de asymmetrische centrale spil op het laatste moment van celdeling ^3,8. Deze studies hebben licht geworpen op de moleculaire mechanismen die de asymmetrische deling in Drosophila SOP-cellen reguleren, maar het is onduidelijk of vergelijkbare endocytische processen optreden bij gewervelde radiale glia-voorlopercellen (RGP’s).

Bovendien zijn de moleculaire mechanismen die asymmetrische Notch / DeltaD-signalering reguleren tijdens de RGP-deling van gewervelde dieren niet goed begrepen. Bij zebravissen is gemeld dat de interactie van Notch en Delta de endocytose van de DeltaD-ligand⁹ vergemakkelijkt. Het is onbekend of DeltaD-endocytose van invloed kan zijn op de celbestemming van dochtercellen in de zich ontwikkelende gewervelde hersenen. Recente studies tonen aan dat het injecteren van fluorescerend geconjugeerde anti-DeltaD-antilichamen in de neurale buis Sara-endosomen specifiek in neuro-epitheliale cellen kan labelen, en anti-DeltaD bevattende Sara-endosomen bij voorkeur scheiden in prolifererende dochtercellen¹⁰. Er is gesuggereerd dat Notch-signalering van de endosomen het lot van de dochtercel zou kunnen reguleren. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat de meeste RGP-cellen van zebravissen in de zich ontwikkelende voorhersenen ACD ondergaan en dat de bepaling van het lot van de dochtercel afhankelijk is van intralineage Notch / DeltaD-signalering¹¹. Om de aard van de intralineage Notch / DeltaD-signalering in zebravis RGP’s op te helderen, hebben we de anti-DeltaD-antilichaamopnametest ontwikkeld in de hersenen van de zebravis. Met behulp van dit protocol hebben we met succes live labeling en beeldvorming van DeltaD endocytische handel in mitotische RGP’s uitgevoerd.

Het fluorescerend gelabelde anti-DeltaD-antilichaam wordt efficiënt geïnternaliseerd in de RGP’s langs de voorhersenen. Het heeft de ontdekking van directionele handel in DeltaD-endosomen in de asymmetrisch verdelende RGP’s^{aanzienlijk vergemakkelijkt 12,13}. Vergeleken met eerdere antilichaamopnameprotocollen die zijn ontwikkeld voor Drosophila notumculturen en het ruggenmerg van de zebravis 10, heeft dit protocol langdurige en zeer efficiënte anti-DeltaD-etikettering in de hersenventrikelcellaag bereikt, met name met minder dan¹⁰ nL micro-geïnjecteerd antilichaammengsel. De achterhersenen ventrikel injectie is erg handig voor het toepassen van de antilichaam opname assay in de zich ontwikkelende hersenen, omdat de achterhersenen ventrikel goed is uitgebreid in zebravis embryo’s en gevuld met cerebrospinale vloeistof in de vroege ontwikkelingsfase¹⁴. Door het antilichaammengsel in de achterhersenkamer te injecteren zonder cruciale ontwikkelende weefsels te verwonden, heeft het protocol mogelijke schade aan de beeldvormingszone in de voorhersenen zoveel mogelijk geminimaliseerd. De verlaagde dosering van het geïnjecteerde primaire antilichaam heeft ook mogelijke bijwerkingen van het interfereren met endogene Delta-Notch-signalering in vivo vermeden. Dit protocol kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere farmacologische of genetische verstoringen, gebruikt in verschillende ontwikkelingsstadia en mogelijk aangepast aan het volwassen brein en menselijke pluripotente stamcel-afgeleide 2D / 3D-hersenorganoïden. Alles bij elkaar heeft het protocol het mogelijk gemaakt om te begrijpen hoe en wanneer Notch-signaleringsasymmetrie wordt vastgesteld tijdens ACD. De belangrijkste uitdaging voor een succesvolle implementatie van dit protocol is het bereiken van nauwkeurige afgifte van geschikte concentraties van het antilichaam op basis van specifieke experimentele omstandigheden.