Summary

이끼 피스코미트리움 파텐스에서 칼코플루오르를 사용한 세포벽 역학의 3D 타임랩스 이미징

Published: February 10, 2023
doi:

Summary

이 원고는 살아있는 이끼 조직의 3D 세포벽 역학을 이미지화하는 상세한 프로토콜을 제시하여 장기간에 걸쳐 발달하는 동안 ggb 돌연변이에서 세포벽의 분리와 야생형의 세포벽 패턴을 두껍게 시각화할 수 있습니다.

Abstract

형광 현미경을 사용한 타임랩스 이미징을 통해 세포 및 세포하 수준에서 성장 및 발달의 동적 변화를 관찰할 수 있습니다. 일반적으로 장기간에 걸친 관찰을 위해이 기술은 형광 단백질의 변형이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전자 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 사용할 수 없습니다. 이 원고는 이끼 Physcomitrium patens에서 개발 된 calcofluor 염료 (식물 세포벽의 셀룰로오스를 염색)를 사용하여 3 일 동안 세포벽 역학의 3D 타임 랩스 이미징을위한 프로토콜을 제시합니다. 세포벽의 칼코플루오르 염료 신호는 안정적이며 명백한 감쇠 없이 1주일 동안 지속될 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 ggb 돌연변이 체 (단백질 제라 닐 제라 닐 트랜스퍼 라제 -I 베타 서브 유닛이 녹아웃 됨)에서 세포의 분리가 조절되지 않은 세포 확장 및 세포벽 무결성 결함으로 인해 발생하는 것으로 나타났습니다. 또한, 칼코 플루오르 염색의 패턴은 시간이 지남에 따라 변합니다. 덜 강하게 염색된 영역은 야생형의 미래 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있습니다. 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.

Introduction

식물 세포벽은 세포 확장 및 발달 동안 역동적 인 변화를 겪습니다 1,2,3. 세포벽 무결성을 유지하는 것은 성장 및 발달 중 식물 세포 접착과 환경 신호에 대한 반응에 매우 중요합니다. 장기간에 걸쳐 살아있는 세포의 세포벽 역학을 시각화하는 것이 개발 및 환경 변화에 적응하는 동안 세포 접착이 유지되는 방법을 이해하는 데 중요하지만 세포벽 역학을 직접 관찰하는 현재의 방법은 여전히 어렵습니다.

세포 변화의 타임 랩스 이미징은 고해상도 형광 현미경 4,5,6,7을 사용하여 유기체의 유익한 발달 역학을 제공 할 수 있습니다. 타임랩스 3D 이미징은 성장 및 발달 중 세포 모양의 동적 변화를 연구할 수 있는 많은 잠재력을 가지고 있지만, 이 기술은 일반적으로 형광 단백질 4,5,6,7의 형질전환이 필요합니다. 그러나 대부분의 시스템에서 유전 적 변형은 시간이 많이 걸리거나 기술적으로 어렵습니다. 대안으로, 세포 성분에 부착되는 형광 염료는 오랫동안 이용 가능해왔다. 형광 염료는 특정 파장의 빛으로 조사 한 후 형광등을 방출 할 수 있습니다. 일반적인 예로는 Edu, DAPI, PI, FM4-64 및 칼코플루오르 화이트 8,9,10이 있습니다. 그러나 한 가지 주요 단점은 이러한 염료가 일반적으로 고정 조직 또는 짧은 실험에만 사용될 수 있다는 것인데, 이는 부분적으로 세포 8,9,10에 대한 피해로 인한 것입니다.

여기에 제시된 프로토콜을 사용하면 이끼 P. patens의 타임 랩스 실험 중에 칼코플루오르 화이트가 배지 내에서 혼합될 때 칼코플루오르 신호가 안정적입니다. 이 방법을 사용하여 3-D 타임 랩스 이미징을 사용하여 ggb 돌연변이 체에서 세포의 분리를 3 일 기간 동안 관찰했습니다3 (그림 1). 이 방법은 세포벽을 포함하고 calcofluor로 염색 될 수있는 다른 많은 시스템에 적용될 수 있습니다.

Protocol

참고: 재료 및 장비 목록은 재료 표를 참조하고 이 프로토콜에서 사용할 솔루션 목록은 표 1 을 참조하십시오. 1. 유리 바닥 접시 용 식물 준비 성장 챔버에서 25°C에서 7일 동안 일정한 백색광(~50μmol m-2s-1) 하에 13cm 페트리 접시의 BCDAT 한천 배지에서 이끼 양성자 조직을 성장시킵니다. 필터-백색의 칼코플루?…

Representative Results

이 방법을 사용하면 야생형 및 ggb 돌연변이체에서 발달하는 동안 세포벽 역학을 관찰할 수 있습니다(그림 1). 결과는 세포벽이 덜 두꺼워지는 영역이 세포 확장/분지 부위와 상관관계가 있어 야생형에서 확장/분지 부위를 예측할 수 있음을 보여주었습니다(그림 1A). ggb 돌연변이체에서 세포벽의 표면은 제어되지 않은 세포 확장<sup class="xref…

Discussion

타임랩스 3D 재구성 또는 4D 이미징은 발달 과정에서 세포 형태의 역학을 관찰하기 위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜에서, 배지에서 칼코 플루오르 화이트를 혼합함으로써, 3-D 세포 형태의 역학이 이끼 P. patens에서 관찰 될 수있다. 이 방법을 사용하여 ggb 돌연변이 체의 세포벽 표면이 발달 중에 찢어지는 것을 관찰했습니다3. 또한, 세포벽의 감소된 농축은 야생?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 컨포칼 현미경에 대한 도움을 준 루이빌 대학의 Soucy Patricia 박사와 Betty Nunn 박사에게 감사를 표합니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (MPR에 1456884)과 국립 과학 재단 협력 협정 (MPR에 1849213)에 의해 자금을 지원했습니다.

Materials

3-mm-thick red plastic light filter  Mitsubishi  no.102
27 mm diameter glass base dish  Iwaki 3930-035
Agar  Sigma A6924
Calcofluor white   Sigma 18909-100ML-F Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope  Nikon  A1

NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Fluorescence microscope  Nikon  TE200  Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum  Nacali Tesque 12389-96
Plant Growth Chambers SANYO  Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter Millipore SLGV033RS

Referências

  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
  3. Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
  4. Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
  5. Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
  6. Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
  7. Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
  8. Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
  9. Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
  10. Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
  11. Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).

Play Video

Citar este artigo
Bao, L., Running, M. P. 3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens. J. Vis. Exp. (192), e64651, doi:10.3791/64651 (2023).

View Video