3-D Time-Lapse Beeldvorming van celwanddynamica met behulp van calcofluor in de Moss Physcomitrium patens
Summary
Dit manuscript presenteert een gedetailleerd protocol om de 3D-celwanddynamiek van levend mosweefsel in beeld te brengen, waardoor de onthechting van celwanden in ggb-mutanten en verdikking van celwandpatronen in het wilde type tijdens de ontwikkeling gedurende een lange periode mogelijk wordt.
Abstract
Time-lapse beeldvorming met fluorescentiemicroscopie maakt observatie van de dynamische veranderingen van groei en ontwikkeling op cellulair en subcellulair niveau mogelijk. Over het algemeen vereist de techniek voor waarnemingen over een lange periode transformatie van een fluorescerend eiwit; voor de meeste systemen is genetische transformatie echter tijdrovend of technisch niet beschikbaar. Dit manuscript presenteert een protocol voor 3D time-lapse beeldvorming van celwanddynamica over een periode van 3 dagen met behulp van calcofluorkleurstof (die cellulose in de celwand van de plant kleurt), ontwikkeld in het mos Physcomitrium patens. Het calcofluorkleurstofsignaal van de celwand is stabiel en kan 1 week meegaan zonder duidelijk verval. Met behulp van deze methode is aangetoond dat het loslaten van cellen in ggb-mutanten (waarbij het eiwit geranylgeranyltransferase-I bèta-subeenheid wordt uitgeschakeld) wordt veroorzaakt door ongereguleerde celexpansie en celwandintegriteitsdefecten. Bovendien veranderen de patronen van calcofluorkleuring in de loop van de tijd; minder intens gekleurde gebieden correleren met de toekomstige celuitbreidings-/vertakkingsplaatsen in het wilde type. Deze methode kan worden toegepast op vele andere systemen die celwanden bevatten en die kunnen worden gekleurd door calcofluor.
Introduction
Celwanden van planten ondergaan dynamische veranderingen tijdens celexpansie en -ontwikkeling 1,2,3. Het handhaven van de integriteit van de celwand is van cruciaal belang voor de hechting van plantencellen tijdens groei en ontwikkeling, evenals voor de reactie op omgevingssignalen. Hoewel het visualiseren van celwanddynamiek van levende cellen over een lange periode van cruciaal belang is om te begrijpen hoe celhechting wordt gehandhaafd tijdens ontwikkeling en aanpassing aan omgevingsveranderingen, zijn de huidige methoden voor het direct observeren van celwanddynamiek nog steeds een uitdaging.
Time-lapse beeldvorming van cellulaire veranderingen kan informatieve ontwikkelingsdynamiek van een organisme bieden met behulp van een fluorescentiemicroscoop met hoge resolutie 4,5,6,7. Hoewel time-lapse 3D-beeldvorming veel potentieel heeft voor het bestuderen van dynamische veranderingen van celvorm tijdens groei en ontwikkeling, vereist de techniek normaal gesproken transformatie van een fluorescerend eiwit 4,5,6,7. Voor de meeste systemen zijn genetische transformaties echter tijdrovend of technisch uitdagend. Als alternatief zijn fluorescerende kleurstoffen die zich hechten aan cellulaire componenten al lang beschikbaar. De fluorescerende kleurstoffen kunnen fluorescerend licht uitzenden na bestraling met licht van een bepaalde golflengte. Veel voorkomende voorbeelden zijn Edu, DAPI, PI, FM4-64 en calcofluor white 8,9,10. Een groot nadeel is echter dat deze kleurstoffen meestal alleen kunnen worden gebruikt in vast weefsel of voor korte experimenten, deels vanwege de schade die ze aan de cel toebrengen 8,9,10.
Met het hier gepresenteerde protocol zijn calcofluorsignalen stabiel wanneer calcofluorwit in het medium wordt gemengd tijdens time-lapse-experimenten in de mos P. patens. Met behulp van deze methode werd het loslaten van cellen in ggb-mutanten met behulp van 3D time-lapse beeldvorming waargenomen gedurende een periode van 3 dagen3 (figuur 1). Deze methode kan worden toegepast op vele andere systemen die celwanden bevatten en die kunnen worden gekleurd door calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Time-lapse 3D-reconstructie, of 4D-beeldvorming, is een krachtig hulpmiddel voor het observeren van de dynamiek van cellulaire morfologie tijdens ontwikkelingsprocessen. In dit protocol kan door het mengen van het calcofluorwit in het medium de dynamiek van 3D cellulaire morfologie worden waargenomen in het mos P. patens. Met behulp van deze methode zagen we dat het oppervlak van celwanden in ggb-mutanten tijdens ontwikkeling3 uit elkaar wordt gescheurd. Bovendien is de verminder…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Dr. Soucy Patricia en Betty Nunn van de Universiteit van Louisville voor hun hulp met de confocale microscoop. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation (1456884 M.P.R.) en door een National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
Referências
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
