Kvantifisering av myeloperoksidase-DNA og nøytrofile elastase-DNA-komplekser fra nøytrofile ekstracellulære feller ved hjelp av en modifisert Sandwich ELISA
Summary
Vi presenterer en protokoll for en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyseteknikk for kvantitativt å måle to komponenter av nøytrofile ekstracellulære fellerestere, myeloperoksidase konjugert-DNA og nøytrofile elastase konjugerte DNA-komplekser, avledet fra aktiverte nøytrofiler.
Abstract
Visse stimuli, som mikroorganismer, forårsaker at nøytrofiler frigjør nøytrofile ekstracellulære feller (NET), som i utgangspunktet er nettlignende strukturer sammensatt av DNA med granulproteiner, som myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE), og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selv om interessen for NET har økt den siste tiden, finnes det ingen sensitiv og pålitelig analysemetode for måling av NET i kliniske settinger. Denne artikkelen beskriver en modifisert sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse for kvantitativt å måle to komponenter av sirkulerende NET, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET. Analysen bruker spesifikke monoklonale antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Denne analysen viser god linearitet og høy inter-assay og intra-assay presisjon. Vi brukte det hos 16 pasienter med COVID-19 med tilhørende akutt lungesviktsyndrom og fant at plasmakonsentrasjonene av MPO-DNA og NE-DNA var signifikant høyere enn i plasma oppnådd fra friske kontroller. Denne deteksjonsanalysen er en pålitelig, svært sensitiv og nyttig metode for å undersøke egenskapene til NET i humane plasma- og kultursupernatanter.
Introduction
Denne artikkelen skisserer en metode for å kvantifisere dannelse av nøytrofil ekstracellulær felle (NET) i biologiske væsker ved å bruke sandwichenzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å oppdage komplekser av myeloperoksidase (MPO) og nøytrofil elastase (NE) med DNA 1,2. NET er sammensatt av en DNA-ryggrad dekorert med antimikrobielle proteaser som stammer fra nøytrofile granulater 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er viktige og spesifikke komponenter i NET og slippes ut i det ekstracellulære rommet som nedbrytningsprodukter fra NET 3,4.
I tillegg til deres viktige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3, har NET også forskjellige patologiske effekter4,5, inkludert fremme av trombogenese6 og forverring av sepsis7. Følgelig har NET fått oppmerksomhet nylig. Likevel har in vivo-kvantifiseringen av NET vist seg utfordrende på grunn av mangelen på en sensitiv, pålitelig kvantitativ analysemetode.
Noen få metoder er tilgjengelige, inkludert direkte måling av NET ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling av sirkulerende cellefritt DNA, nukleosomer og citrullinert histon H3, men hver metode har sine egne fordeler og begrensninger11. Selv om immunfluorescensmikroskopisk metode er spesifikk for NET og tydelig viser lokalisering og grad av NET-dannelse, er prøvene begrenset til biopsivev og utskilte materialer. Dessuten må denne metoden utføres av dyktige forskere og krever lang tid for at resultatene skal oppnås. Måling av sirkulerende nivåer av NET-relaterte komponenter ved flowcytometri er enkelt og gir resultater raskt; Metoden er imidlertid ikke spesifikk for NET12.
Vi13 og andre1,2 har utviklet en svært sensitiv og pålitelig analyse for å måle de sirkulerende NET-komponentene, MPO-konjugert eller NE-konjugert DNA, i humant plasma med en modifisert ELISA-teknikk som bruker spesifikke antistoffer for MPO eller NE som fangstantistoffer og et DNA-spesifikt deteksjonsantistoff. Denne analysen kan også brukes ex vivo for å identifisere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigjort av aktiverte nøytrofiler som respons på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode der MPO eller NE binder seg til ett sted av fangstantistoffet under den første inkubasjonen av prøver som inneholder MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Etter vask blir “sandwich” fullført ved å inkubere prøvene med et peroksidase-assosiert anti-DNA monoklonalt antistoff. Etter fjerning av ubundet sekundært antistoff detekteres det bundne peroksidasekonjugatet ved tilsetning av et kromogent ABTS-peroksidasesubstrat, som gir et løselig sluttprodukt som kan leses spektrofotome…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for hjelp til å gjennomgå manuskriptet.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
Referências
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
