Kvantifiering av myeloperoxidas-DNA och neutrofila elastas-DNA-komplex från neutrofila extracellulära fällor med hjälp av en modifierad sandwich-ELISA
Summary
Vi presenterar ett protokoll för en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analysteknik för att kvantitativt mäta två komponenter av neutrofila extracellulära fällrester, myeloperoxidaskonjugerat DNA och neutrofilelastaskonjugerade DNA-komplex, härledda från aktiverade neutrofiler.
Abstract
Vissa stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler att frigöra neutrofila extracellulära fällor (NET), som i grunden är nätliknande strukturer som består av DNA med granulära proteiner, såsom myeloperoxidas (MPO) och neutrofila elastas (NE), och cytoplasmatiska och cytoskelettala proteiner. Även om intresset för NET har ökat på senare tid finns det ingen känslig och tillförlitlig analysmetod för att mäta NET i kliniska miljöer. Denna artikel beskriver en modifierad sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys för att kvantitativt mäta två komponenter av cirkulerande NET, MPO-DNA och NE-DNA-komplex, som är specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära utrymmet som nedbrytningsprodukter av NET. Analysen använder specifika monoklonala antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. MPO eller NE binder till ett ställe för infångningsantikroppen under den första inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Denna analys visar god linjäritet och hög precision mellan och inom analysen. Vi använde det på 16 patienter med covid-19 med åtföljande akut andnödssyndrom och fann att plasmakoncentrationerna av MPO-DNA och NE-DNA var signifikant högre än i plasma från friska kontroller. Denna detektionsanalys är en tillförlitlig, mycket känslig och användbar metod för att undersöka egenskaperna hos NET i humanplasma och odlingssupernatanter.
Introduction
Denna artikel beskriver en metod för att kvantifiera neutrofil extracellulär fällbildning (NET) i biologiska vätskor genom att använda sandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) för att detektera komplex av myeloperoxidas (MPO) och neutrofil elastas (NE) med DNA 1,2. NET består av en DNA-ryggrad dekorerad med antimikrobiella proteaser som härrör från neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- och NE-DNA-komplex är viktiga och specifika komponenter i NET och släpps ut i det extracellulära rummet som nedbrytningsprodukter av NET 3,4.
Förutom sin viktiga fysiologiska roll i det antimikrobiella försvaret3 har NET också olika patologiska effekter4,5, inklusive främjande av trombogenes6 och försämring av sepsis7. Följaktligen har NET fått uppmärksamhet nyligen. Icke desto mindre har in vivo-kvantifieringen av NET visat sig vara utmanande på grund av bristen på en känslig, tillförlitlig kvantitativ analysmetod.
Ett fåtal metoder finns tillgängliga, inklusive direkt mätning av NET med fluorescensmikroskopi8,9 och flödescytometri 10 och indirekt mätning av cirkulerande cellfritt DNA, nukleosomer och citrullinerad histon H3, men varje metod har sina egna fördelar och begränsningar11. Även om den immunofluorescensmikroskopiska metoden är specifik för NET och tydligt visar lokalisering och grad av NET-bildning, är proverna begränsade till biopsivävnad och utsöndrade material. Dessutom behöver denna metod utföras av skickliga forskare och kräver lång tid för att resultat ska erhållas. Att mäta cirkulerande nivåer av NET-relaterade komponenter med flödescytometri är enkelt och ger snabba resultat. Metoden är dock inte specifik för NET12.
Vi13 och andra1,2 har utvecklat en mycket känslig och tillförlitlig analys för att mäta de cirkulerande NET-komponenterna, MPO-konjugerat eller NE-konjugerat DNA, i human plasma med en modifierad ELISA-teknik som använder specifika antikroppar för MPO eller NE som infångningsantikroppar och en DNA-specifik detektionsantikropp. Denna analys kan också användas ex vivo för att identifiera NET-komponenter i cellodlingssupernatanter som frisätts av aktiverade neutrofiler som svar på phorbol 12-myristate 13-acetat (PMA) stimulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har beskrivit en sandwich ELISA-metod där MPO eller NE binder till ett ställe av infångningsantikroppen under den initiala inkubationen av prover som innehåller MPO-DNA eller NE-DNA-komplex. Efter tvättning avslutas “sandwichen” genom att proverna inkuberas med en peroxidasassocierad monoklonal anti-DNA-antikropp. Efter avlägsnande av obundna sekundära antikroppar detekteras det bundna peroxidaskonjugatet genom tillsats av ett kromogent ABTS-peroxidassubstrat, vilket ger en löslig slutprodukt som kan avläsas …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr. Huq Muhammad Aminul för att ha hjälpt till med att granska manuskriptet.
Materials
| 1-Step Polymorphs | Accurate Chemical and Scientific Corporation | AN221725 | Isolation of PMN's from human blood. |
| 96-well microtiter plate | Thermo Fisher Scientific | 467466 | flat bottom |
| ABTS buffer solution | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 530 001 | Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. |
| ABTS tablets | Sigma-Aldrich Merck | 11 204 521 001 | Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances. |
| Adhesive plastic cover, Axygen | Thermo Fisher Scientific | 14222348 | |
| Anti-MPO antibody | Sigma-Aldrich Merck | 07-496-I | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit. |
| Anti-NE antibody, clone AHN-10 | Sigma-Aldrich Merck | MABS461 | Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse. |
| Bovine serum albumin | Biomedical Science | BR-220700081 | Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year. |
| DNase I | New England BioLabs | M0303M | Store at -20 °C |
| IgG, rabbit, Isotype Control | GENETEX, Inc. | GTX35035 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 | Merck | MABC002 | Store as concentrated solution at 2–8 °C. |
| Lithium heparin blood collection tube | Becton Dickinson and Company | ||
| Microplate mixer | As one corporation | NS-P | |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax 190 | Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use. |
| Microplate reader application | Molecular Devices | SoftMax pro | |
| Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA | Roche Diagnostics | 1154467500 | bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year. |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich Merck | P8139 | Activation of PMN's from human blood. |
| Phosphate buffered solution | Takara Bio | T9181 | Store at room temperature. Stable for 6 months. |
| SigmaPlot v14.5 | Systat Software Inc. San Jose, CA, USA | ||
| Sodium azide | Fujifilm Wako Chemicals | 190-14901 | Store at room temperature. |
| t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fujifilm Wako Chemicals | 9002-93-1 | Store at room temperature. |
Referências
- Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
- Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
- Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
- Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
- Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
- Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
- Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
- Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
- Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
- Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
- Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
- Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
- Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
- Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
- Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
- Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).
