JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Kvantificering af myeloperoxidase-DNA og neutrofile elastase-DNA-komplekser fra neutrofile ekstracellulære fælder ved hjælp af en modificeret sandwich-ELISA

Published: May 12, 2023
doi:
10.3791/64644
, , , ,
1Department of Biochemistry and Biotechnology,University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine,Aichi Medical University

Summary

Vi præsenterer en protokol for en modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassayteknik til kvantitativt at måle to komponenter af neutrofile ekstracellulære fælderester, myeloperoxidasekonjugeret DNA og neutrofilelastasekonjugerede DNA-komplekser, afledt af aktiverede neutrofiler.

Abstract

Visse stimuli, såsom mikroorganismer, får neutrofiler til at frigive neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er), som grundlæggende er weblignende strukturer sammensat af DNA med granulatproteiner, såsom myeloperoxidase (MPO) og neutrofil elastase (NE) og cytoplasmatiske og cytoskeletale proteiner. Selvom interessen for NETs er steget for nylig, findes der ingen følsom, pålidelig analysemetode til måling af NETs i kliniske omgivelser. Denne artikel beskriver et modificeret sandwichenzymbundet immunosorbentassay til kvantitativt at måle to komponenter i cirkulerende NET’er, MPO-DNA og NE-DNA-komplekser, som er specifikke komponenter i NET’er og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NET’er. Assayet bruger specifikke monoklonale antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. MPO eller NE binder sig til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA- eller NE-DNA-komplekser. Dette assay viser god linearitet og høj inter-assay og intra-assay præcision. Vi brugte det hos 16 patienter med COVID-19 med ledsagende akut respiratorisk distress syndrom og fandt ud af, at plasmakoncentrationerne af MPO-DNA og NE-DNA var signifikant højere end i plasma opnået fra raske kontroller. Denne detektionsanalyse er en pålidelig, meget følsom og nyttig metode til undersøgelse af NETs karakteristika i humane plasma- og kultursupernatanter.

Introduction

Denne artikel skitserer en metode til kvantificering af dannelse af neutrofil ekstracellulær fælde (NET) i biologiske væsker ved anvendelse af sandwichenzymbundet immunosorbentassay (ELISA) til påvisning af komplekser af myeloperoxidase (MPO) og neutrofilelastase (NE) med DNA 1,2. NETs består af en DNA-rygrad dekoreret med antimikrobielle proteaser, der stammer fra neutrofilgranulat 3,4. Både MPO-DNA- og NE-DNA-komplekser er vigtige og specifikke komponenter i NETs og frigives i det ekstracellulære rum som nedbrydningsprodukter af NETs 3,4.

Udover deres vigtige fysiologiske rolle i antimikrobielt forsvar3 har NET’er også forskellige patologiske virkninger4,5, herunder fremme af trombogenese6 og forværring af sepsis7. Derfor har NETs fået opmærksomhed for nylig. Ikke desto mindre har de vivo-kvantificeringen af NETs vist sig at være en udfordring på grund af manglen på en følsom, pålidelig kvantitativ analysemetode.

Nogle få metoder er tilgængelige, herunder direkte måling af NET’er ved fluorescensmikroskopi8,9 og flowcytometri 10 og indirekte måling af cirkulerende cellefrit DNA, nukleosomer og citrullineret histon H3, men hver metode har sine egne fordele og begrænsninger11. Selvom den immunofluorescensmikroskopiske metode er specifik for NET’er og tydeligt viser lokalisering og grad af NET-dannelse, er prøver begrænset til biopsivæv og udskillede materialer. Desuden skal denne metode udføres af dygtige forskere og kræver lang tid for at opnå resultater. Måling af cirkulerende niveauer af NET-relaterede komponenter ved flowcytometri er let og giver resultater hurtigt; Metoden er imidlertid ikke specifik for NETs12.

Vi13 og andre1,2 har udviklet et meget følsomt og pålideligt assay til måling af de cirkulerende NET-komponenter, MPO-konjugeret eller NE-konjugeret DNA, i humant plasma med en modificeret ELISA-teknik, der bruger specifikke antistoffer til MPO eller NE som indfangningsantistoffer og et DNA-specifikt detektionsantistof. Dette assay kan også anvendes ex vivo til at identificere NET-komponenter i cellekultursupernatanter frigivet af aktiverede neutrofiler som reaktion på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) stimulering.

Protocol

Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med Helsingforserklæringen og blev godkendt af de institutionelle bedømmelsesudvalg ved Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver deltager. 1. Fremstilling af reagens BEMÆRK: For at udføre sandwich-ELISA-analysen fremstilles reagenserne som beskrevet nedenfor. Belægning buffer:For at lave en 0,1 mol / L carbona…

Representative Results

Denne metode anvendte en sandwich ELISA med anti-MPO, anti-NE og anti-DNA monoklonale antistoffer til måling af MPO-associeret og NE-associeret DNA (figur 1). I denne metode blev brøndene i en mikrotiterplade belagt med et MPO-specifikt eller NE-specifikt monoklonalt antistof for at fange DNA-associeret MPO og DNA-associeret NE såvel som ikke-DNA-associeret MPO og NE. For at beregne intra-assay-variabilitetskoefficienten (CV) blev der udført dobbeltmålinger inden for samme plade for 30 …

Discussion

Vi har beskrevet en sandwich ELISA-metode, hvor MPO eller NE binder til et sted af indfangningsantistoffet under den indledende inkubation af prøver indeholdende MPO-DNA eller NE-DNA-komplekser. Efter vask afsluttes “sandwich” ved at inkubere prøverne med et peroxidaseassocieret anti-DNA monoklonalt antistof. Efter fjernelse af ubundet sekundært antistof påvises det bundne peroxidasekonjugat ved tilsætning af et kromogent ABTS-peroxidasesubstrat, som giver et opløseligt slutprodukt, der kan aflæses spectrophotomet…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takker Dr. Huq Muhammad Aminul for at have hjulpet med at gennemgå manuskriptet.

Materials

1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps – The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Keywords: Myeloperoxidase-DNANeutrophil Elastase-DNANETsELISASepsisARDSDamage-associated Molecular PatternsPolymorphonuclear NeutrophilsPMADNase IEDTA
check_url/pt/64644?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image