Nethinden er et lysfølsomt væv til stede bag på hvirveldyrets øje, der omdanner lyssignaler til nerveimpulser ved et biokemisk fænomen kendt som fototransduktionsvejen. De indledende nerveimpulser, der genereres i nethindens fotoreceptorceller, transduceres til andre retinale interneuroner og retinale ganglionceller (RGC’er) og når hjernens visuelle cortex, hvilket hjælper med billedopfattelse og visuel respons.

Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er anslået 1,5 millioner børn blinde, hvoraf 1 million er i Asien. Arvelig retinal dystrofi (IRD) er en alvorlig blindende sygdom, der rammer 1 ud af 4.000 individer over hele verden ^1,2,3, mens forekomsten af blindhed forbundet med aldersrelateret makuladegeneration (AMD) varierer fra 0,6% –^1,1% i udviklingslande ⁴. IRD’er er forårsaget af arvelige genetiske defekter i over 300 forskellige gener, der er involveret i retinal udvikling og funktion⁵. Sådanne genetiske ændringer resulterer i forstyrrelse af normale retinale funktioner og gradvis degeneration af retinale celler, nemlig fotoreceptorcellerne og det retinale pigmenterede epitel (RPE), hvilket fører til alvorligt synstab og blindhed. Der er gjort enorme fremskridt under andre blændende forhold, der involverer hornhinden, linsen osv. Imidlertid har retinale dystrofier og optiske nerveatrofier ikke nogen dokumenteret terapi til dato. Da en voksen menneskelig nethinde ikke har stamceller⁶, kan alternative kilder såsom embryonale stamceller (ESC’er) og patientafledte inducerede pluripotente stamceller (iPSC’er) give et ubegrænset udbud af ønskede celletyper og have et stort løfte om udvikling af komplekse vævsorganoider, der kræves til in vitro-sygdomsmodelleringsundersøgelser og til udvikling af regenerative terapier^{7, 8,9,10}.

Flere års retinal forskning har ført til en bedre forståelse af molekylære begivenheder, der orkestrerer tidlig retinal udvikling. De fleste protokoller til generering af retinale celler og 3D-organoider fra PSC’er sigter mod at rekapitulere disse udviklingsbegivenheder in vitro ved at dyrke cellerne i en kompleks cocktail af vækstfaktorer og små molekyler for at modulere de kendte biologiske processer trinvist. De retinale organoider, der således genereres, består af store retinale celler: retinale ganglionceller (RGC’er), interneuroner, fotoreceptorer og retinal pigmenteret epitel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19. På trods af vellykkede forsøg på at modellere IRD’er ved hjælp af retinale organoider udgør kravet om den komplekse cocktail af vækstfaktorer og små molekyler under differentiering og den relativt lave effektivitet af retinal organoidgenerering en stor udfordring med de fleste protokoller. De omfatter hovedsageligt dannelsen af embryoidlegemer efterfulgt af deres trinvise differentiering i retinale slægter ved hjælp af komplekse kulturbetingelser på forskellige stadier af in vitro-udvikling ^20,21,22.

Her rapporteres en forenklet og robust metode til udvikling af komplekse 3D neuro-retinale organoider fra sund kontrol og retinale sygdomsspecifikke hiPSC’er. Protokollen beskrevet her anvender direkte differentiering af nær-sammenflydende hiPSC-kulturer uden behov for embryoid kropsdannelse. Kompleksiteten af kulturmediet er også forenklet, hvilket gør det til en omkostningseffektiv og reproducerbar teknik, der let kan vedtages af nye forskere. Det involverer et hybridkultursystem bestående af vedhængende enkeltlagskulturer i løbet af de første 4 uger af retinal differentiering indtil fremkomsten af forskellige, selvorganiserede øjenfeltprimordialklynger (EFP’er). Endvidere plukkes de cirkulære neuro-retinale øer inden for hver EFP manuelt og dyrkes i suspensionskulturer i 1-2 uger for at forberede flerlags 3D retinale kopper eller organoider bestående af PAX6 ⁺ og CHX10 ⁺ prolifererende neuro-retinale forløbere. Udvidet dyrkning af retinale organoider i 100 μM taurinholdigt medium i yderligere 4 uger resulterede i fremkomsten af RCVRN ⁺ og CRX⁺ fotoreceptorprækursorer og modne celler med rudimentære indre segmentlignende forlængelser.