यह प्रोटोकॉल एचआईपीएससी को आंख क्षेत्र समूहों में अलग करने और सरलीकृत संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके न्यूरो-रेटिना ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न करने की एक कुशल विधि का वर्णन करता है जिसमें अनुयायी और निलंबन संस्कृति प्रणाली दोनों शामिल हैं। अन्य ओकुलर सेल प्रकार, जैसे आरपीई और कॉर्नियल एपिथेलियम, रेटिना संस्कृतियों में परिपक्व आंख क्षेत्रों से भी अलग किए जा सकते हैं।
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल जटिल ऊतक ऑर्गेनोइड उत्पन्न कर सकते हैं जो इन विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययन और पुनर्योजी उपचार विकसित करने के लिए उपयोगी हैं। यह प्रोटोकॉल एक हाइब्रिड कल्चर सिस्टम में रेटिना ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने की एक सरल, मजबूत और चरणबद्ध विधि का वर्णन करता है, जिसमें रेटिना भेदभाव के पहले 4 हफ्तों के दौरान अलग, स्व-संगठित नेत्र क्षेत्र प्राइमर्डियल क्लस्टर (ईएफपी) के उद्भव तक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृतियां शामिल हैं। इसके अलावा, प्रत्येक ईएफपी के भीतर डोनट के आकार के, गोलाकार और पारभासी न्यूरो-रेटिना द्वीपों को मैन्युअल रूप से चुना जाता है और मल्टीलेयर 3 डी ऑप्टिक कप (ओसी -1 एम) उत्पन्न करने के लिए 1-2 सप्ताह के लिए रेटिना भेदभाव माध्यम में गैर-अनुयायी संस्कृति व्यंजनों का उपयोग करके निलंबन के तहत सुसंस्कृत किया जाता है। इन अपरिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स में पैक्स 6 + और सीएचएक्स 10 + प्रसार, मल्टीपोटेंट रेटिना अग्रदूत होते हैं। अग्रदूत कोशिकाएं ऑर्गेनोइड्स के भीतर रैखिक रूप से स्व-इकट्ठी होती हैं और अलग-अलग रेडियल स्ट्राइक के रूप में दिखाई देती हैं। निलंबन संस्कृति के 4 सप्ताह बाद, रेटिना पूर्वजों को परिपक्व रेटिना ऑर्गेनोइड्स (ओसी -2 एम) बनाने के लिए पोस्ट-माइटोटिक गिरफ्तारी और वंश भेदभाव से गुजरना पड़ता है। फोटोरिसेप्टर वंश प्रतिबद्ध अग्रदूत रेटिना ऑर्गेनोइड्स की सबसे बाहरी परतों के भीतर विकसित होते हैं। ये सीआरएक्स + और आरसीवीआरएन + फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं आंतरिक खंड जैसे एक्सटेंशन प्रदर्शित करने के लिए रूपात्मक रूप से परिपक्व होती हैं। इस विधि को मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड ्स उत्पन्न करने के लिए अपनाया जा सकता है। प्रतिकृति सुनिश्चित करने और बुनियादी विज्ञान और अनुवाद अनुसंधान में व्यापक अनुप्रयोगों के लिए सभी चरणों और प्रक्रियाओं को स्पष्ट रूप से समझाया और प्रदर्शित किया गया है।
रेटिना कशेरुक आंख के पीछे मौजूद एक प्रकाश-संवेदनशील ऊतक है जो प्रकाश संकेतों को एक जैव रासायनिक घटना द्वारा तंत्रिका आवेगों में परिवर्तित करता है जिसे फोटो-ट्रांसडक्शन मार्ग के रूप में जाना जाता है। रेटिना की फोटोरिसेप्टर कोशिकाओं में उत्पन्न प्रारंभिक तंत्रिका आवेग अन्य रेटिना इंटरन्यूरॉन और रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) में स्थानांतरित हो जाते हैं और मस्तिष्क के दृश्य कॉर्टेक्स तक पहुंचते हैं, जो छवि धारणा और दृश्य प्रतिक्रिया में मदद करता है।
विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) के अनुसार, अनुमानित 1.5 मिलियन बच्चे अंधे हैं, जिनमें से 1 मिलियन एशिया में हैं। वंशानुगत रेटिना डिस्ट्रॉफी (आईआरडी) एक प्रमुख अंधा बीमारी है जो दुनिया भर में 4,000 व्यक्तियों में से 1 को प्रभावित करती है 1,2,3, जबकि उम्र से संबंधित मैकुलर अपघटन (एएमडी) से जुड़े अंधेपन की व्यापकताविकासशील देशों में 0.6% –1.1% तक होती है। आईआरडी रेटिना विकास और कार्य5 में शामिल 300 से अधिक विभिन्न जीनों में विरासत में मिले आनुवंशिक दोषों के कारण होते हैं। इस तरह के आनुवंशिक परिवर्तनों के परिणामस्वरूप सामान्य रेटिना कार्यों में व्यवधान होता है और रेटिना कोशिकाओं का क्रमिक अध: पतन होता है, अर्थात् फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई), इस प्रकार गंभीर दृष्टि हानि और अंधापन होता है। कॉर्निया, लेंस आदि से जुड़ी अन्य अंधा स्थितियों में भारी प्रगति हुई है। हालांकि, रेटिना डिस्ट्रोफी और ऑप्टिक तंत्रिका एट्राफियों में आज तक कोई सिद्ध चिकित्सा नहीं है। चूंकि एक वयस्क मानव रेटिना में स्टेम सेल6 नहीं होते हैं, इसलिए भ्रूण स्टेम सेल (ईएससी) और रोगी-व्युत्पन्न प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) जैसे वैकल्पिक स्रोत वांछित सेल प्रकारों की असीमित आपूर्ति प्रदान कर सकते हैं और इन विट्रो रोग मॉडलिंग अध्ययनों के लिए आवश्यक जटिल ऊतक ऑर्गेनोइड्स विकसित करने और पुनर्योजी उपचार विकसित करने के लिए एक महान वादा रखते हैं। 8,9,10.
रेटिना अनुसंधान के कई वर्षों ने आणविक घटनाओं की बेहतर समझ पैदा की है जो प्रारंभिक रेटिना विकास को व्यवस्थित करते हैं। पीएससी से रेटिना कोशिकाओं और 3 डी ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए अधिकांश प्रोटोकॉल का उद्देश्य इन विकास ता्मक घटनाओं को विट्रो में पुन: उत्पन्न करना है, विकास कारकों और छोटे अणुओं के जटिल कॉकटेल में कोशिकाओं को विकसित करके ज्ञात जैविक प्रक्रियाओं को चरणबद्ध तरीके से संशोधित करना है। इस प्रकार उत्पन्न रेटिना ऑर्गेनोइड्स में प्रमुख रेटिना कोशिकाएं शामिल हैं: रेटिना गैंग्लियन कोशिकाएं (आरजीसी), इंटरन्यूरॉन, फोटोरिसेप्टर, और रेटिना पिगमेंटेड एपिथेलियम (आरपीई) 11,12,13,14,15,16,17,18,19।. रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके आईआरडी मॉडलिंग के सफल प्रयासों के बावजूद, भेदभाव के दौरान विकास कारकों और छोटे अणुओं के जटिल कॉकटेल की आवश्यकता और रेटिना ऑर्गेनॉइड पीढ़ी की अपेक्षाकृत कम दक्षता अधिकांश प्रोटोकॉल के साथ एक बड़ी चुनौती है। इनमें प्रमुख रूप से भ्रूण निकायों का गठन शामिल है, इसके बाद इन विट्रो विकास20,21,22 के विभिन्न चरणों में जटिल संस्कृति स्थितियों का उपयोग करके रेटिना वंशावली में उनके चरणबद्ध भेदभाव शामिल हैं।
यहां, स्वस्थ नियंत्रण और रेटिना रोग-विशिष्ट एचपीएससी से जटिल 3 डी न्यूरो-रेटिना ऑर्गेनोइड्स विकसित करने की एक सरलीकृत और मजबूत विधि बताई गई है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल भ्रूण शरीर के गठन की आवश्यकता के बिना निकट-कॉन्फ्लुएंट एचआईपीएस संस्कृतियों के प्रत्यक्ष भेदभाव का उपयोग करता है। इसके अलावा, संस्कृति माध्यम की जटिलता को सरल बनाया गया है, जिससे यह एक लागत प्रभावी और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक बन जाती है जिसे नए शोधकर्ताओं द्वारा आसानी से अपनाया जा सकता है। इसमें एक संकर संस्कृति प्रणाली शामिल है जिसमें रेटिना भेदभाव के पहले 4 हफ्तों के दौरान अलग-अलग, स्व-संगठित नेत्र क्षेत्र आदिम समूहों (ईएफपी) के उद्भव तक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृतियां शामिल हैं। इसके अलावा, प्रत्येक ईएफपी के भीतर गोलाकार न्यूरो-रेटिना द्वीपों को मैन्युअल रूप से चुना जाता है और 1-2 सप्ताह के लिए निलंबन संस्कृतियों में उगाया जाता है ताकि पैक्स 6 + और सीएचएक्स 10 + प्रसार न्यूरो-रेटिना अग्रदूतों से युक्त बहुस्तरीय 3 डी रेटिना कप या ऑर्गेनोइड तैयार किए जा सकें। आगे 4 सप्ताह के लिए 100 μM टॉरिन युक्त माध्यम में रेटिना ऑर्गेनोइड्स की विस्तारित संस्कृति के परिणामस्वरूप RCVRN + और CRX + फोटोरिसेप्टर अग्रदूतों और अल्पविकसित आंतरिक खंड जैसे विस्तार के साथ परिपक्व कोशिकाओं का उद्भव हुआ।
HIPSC विट्रो में अंग और ऊतक विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं। रेटिना वंश की ओर स्वस्थ बनाम रोग-विशिष्ट एचपीएससी को अलग करके रोग फेनोटाइप को पुन: परिभाषित करने से विरासत में मिली रेटिन?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक डॉ चित्रा कन्नाबिरन, आनुवंशिकीविद् से वैज्ञानिक और तकनीकी समर्थन को स्वीकार करते हैं; डॉ. सुभद्रा जलाली, रेटिनल कंसल्टेंट; डॉ. मिलिंद नाइक, जनरल मेड़ीसिन डॉकटर / और डॉ स्वाति कलिकी, एलवी प्रसाद आई इंस्टीट्यूट, हैदराबाद में ओकुलर ऑन्कोलॉजिस्ट सामान्य और रोगी-विशिष्ट आईपीएससी लाइनों की पीढ़ी की ओर। लेखक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान बोर्ड, विज्ञान और प्रौद्योगिकी विभाग (आईएम), (एसबी/एसओ/एचएस/177/2013), जैव प्रौद्योगिकी विभाग (आईएम), (बीटी/पीआर32404/एमईडी/30/2136/2019) और आईसीएमआर (एसएम, डीपी), यूजीसी (टीए) और सीएसआईआर (वीकेपी), भारत सरकार से वरिष्ठ अनुसंधान फैलोशिप से अनुसंधान एवं विकास अनुदान स्वीकार करते हैं।
0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
6 well plates | TPP | 92006 | |
Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |