توليد عضويات الشبكية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وأمراض الشبكية الصحية والخاصة بأمراض الشبكية
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للتمييز بين hiPSCs إلى مجموعات مجال العين وتوليد عضويات عصبية شبكية باستخدام ظروف ثقافة مبسطة تتضمن أنظمة ثقافة ملتصقة ومعلقة. يمكن أيضا عزل أنواع خلايا العين الأخرى ، مثل RPE وظهارة القرنية ، من حقول العين الناضجة في مزارع الشبكية.
Abstract
يمكن للخلايا الجذعية متعددة القدرات أن تولد عضويات أنسجة معقدة مفيدة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير علاجات تجديدية. يصف هذا البروتوكول طريقة أبسط وقوية وتدريجية لتوليد عضويات شبكية العين في نظام مزرعة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال أول 4 أسابيع من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية والشفافة على شكل دونات داخل كل EFP يدويا واستزراعها تحت التعليق باستخدام أطباق استزراع غير ملتصقة في وسط تمايز الشبكية لمدة 1-2 أسابيع لتوليد أكواب بصرية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات (OC-1M). تحتوي هذه الكائنات العضوية غير الناضجة في شبكية العين على سلائف شبكية متعددة القدرات تتكاثر PAX6+ و ChX10 +. يتم تجميع خلايا السلائف خطيا ذاتيا داخل الكائنات العضوية وتظهر على شكل تشققات شعاعية متميزة. في 4 أسابيع بعد زراعة التعليق ، يخضع أسلاف الشبكية للتوقف بعد الانقسام وتمايز النسب لتشكيل عضويات شبكية ناضجة (OC-2M). تتطور السلائف الملتزم بها من سلالة المستقبلات الضوئية داخل الطبقات الخارجية من عضويات الشبكية. تنضج خلايا مستقبلات الضوء CRX + و RCVRN + هذه شكليا لعرض امتدادات تشبه الجزء الداخلي. يمكن اعتماد هذه الطريقة لتوليد عضويات شبكية العين باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs). يتم شرح جميع الخطوات والإجراءات بوضوح وإثباتها لضمان إمكانية التكرار وللتطبيقات الأوسع في العلوم الأساسية والبحوث الانتقالية.
Introduction
شبكية العين هي نسيج حساس للضوء موجود في الجزء الخلفي من عين الفقاريات يحول إشارات الضوء إلى نبضات عصبية من خلال ظاهرة كيميائية حيوية تعرف باسم مسار نقل الضوء. يتم نقل النبضات العصبية الأولية المتولدة في الخلايا المستقبلة للضوء في شبكية العين إلى الخلايا العصبية الشبكية الأخرى وخلايا العقدة الشبكية (RGCs) وتصل إلى القشرة البصرية للدماغ ، مما يساعد في إدراك الصورة والاستجابة البصرية.
وفقا لمنظمة الصحة العالمية (WHO) ، يقدر أن 1.5 مليون طفل مصابون بالعمى ، منهم مليون طفل في آسيا. ضمور الشبكية الوراثي (IRD) هو مرض رئيسي يسبب العمى يصيب 1 من كل 4000 فرد في جميع أنحاء العالم 1،2،3 ، في حين أن انتشار العمى المرتبط بالضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD) يتراوح بين 0.6٪ –1.1٪ في البلدان النامية4. تحدث IRDs بسبب عيوب وراثية موروثة في أكثر من 300 جين مختلف يشارك في نمو الشبكية ووظيفتها5. تؤدي هذه التغيرات الجينية إلى تعطيل وظائف الشبكية الطبيعية والتنكس التدريجي لخلايا الشبكية ، وهي الخلايا المستقبلة للضوء وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE) ، مما يؤدي إلى فقدان البصر الشديد والعمى. تم إحراز تقدم هائل في حالات العمى الأخرى التي تشمل القرنية والعدسة وما إلى ذلك. ومع ذلك ، فإن ضمور الشبكية وضمور العصب البصري ليس لديهم أي علاج مثبت حتى الآن. نظرا لأن شبكية العين البشرية البالغة لا تحتوي على خلايا جذعية6 ، فإن المصادر البديلة مثل الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs) والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من المريض (iPSCs) يمكن أن توفر إمدادات غير محدودة من أنواع الخلايا المرغوبة وتحمل وعدا كبيرا لتطوير عضويات الأنسجة المعقدة المطلوبة لدراسات نمذجة الأمراض في المختبر ولتطوير العلاجات التجديدية7 ، 8,9,10.
أدت عدة سنوات من أبحاث الشبكية إلى فهم أفضل للأحداث الجزيئية التي تنظم تطور الشبكية المبكر. تهدف معظم البروتوكولات لتوليد خلايا شبكية العين وعضويات 3D من PSCs إلى تلخيص هذه الأحداث التنموية في المختبر ، عن طريق زراعة الخلايا في مزيج معقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتعديل العمليات البيولوجية المعروفة بطريقة تدريجية. تتكون عضويات الشبكية المتولدة على هذا النحو من خلايا الشبكية الرئيسية: خلايا العقدة الشبكية (RGCs) ، والخلايا العصبية البينية ، والمستقبلات الضوئية ، وظهارة الشبكية المصطبغة (RPE)11،12،13،14،15،16،17،18،19. على الرغم من المحاولات الناجحة لنمذجة IRDs باستخدام عضويات الشبكية ، فإن متطلبات المزيج المعقد من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة أثناء التمايز والكفاءة المنخفضة نسبيا لتوليد عضويات الشبكية تشكل تحديا كبيرا مع معظم البروتوكولات. وهي تشمل بشكل رئيسي تكوين الأجسام الجنينية ، يليها تمايزها التدريجي إلى سلالات شبكية باستخدام ظروف الثقافة المعقدة في مراحل مختلفة من التطور في المختبر 20،21،22.
هنا ، تم الإبلاغ عن طريقة مبسطة وقوية لتطوير عضويات شبكية العين العصبية 3D المعقدة من التحكم الصحي و hiPSCs الخاصة بأمراض الشبكية. يستخدم البروتوكول الموصوف هنا التمايز المباشر لثقافات hiPSC شبه المتقاربة دون الحاجة إلى تكوين جسم جنيني. أيضا ، يتم تبسيط تعقيد وسيط الاستزراع ، مما يجعله تقنية فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتكرار يمكن اعتمادها بسهولة من قبل الباحثين الجدد. وهو ينطوي على نظام ثقافة هجين يتكون من ثقافات أحادية الطبقة ملتصقة خلال الأسابيع ال 4 الأولى من تمايز الشبكية حتى ظهور مجموعات أولية متميزة ومنظمة ذاتيا لمجال العين (EFPs). علاوة على ذلك ، يتم اختيار الجزر العصبية الشبكية الدائرية داخل كل EFP يدويا وزراعتها في مزارع معلقة لمدة 1-2 أسابيع لإعداد أكواب شبكية ثلاثية الأبعاد متعددة الطبقات أو عضويات تتكون من سلائف الشبكية العصبية الشبكية المتكاثرة PAX6 + و CHX10 +. أدت الزراعة الممتدة لعضويات الشبكية في وسط يحتوي على 100 ميكرومتر من التورين لمدة 4 أسابيع أخرى إلى ظهور سلائف مستقبلات الضوء RCVRN + و CRX + والخلايا الناضجة ذات امتدادات بدائية تشبه الجزء الداخلي.
Protocol
Representative Results
Discussion
hiPSCs هي أداة قوية لدراسة تطور الأعضاء والأنسجة في المختبر. يمكن أن يساعد تلخيص النمط الظاهري للمرض من خلال التمييز بين hiPSCs الصحية مقابل hiPSCs الخاصة بالمرض تجاه سلالة الشبكية في اكتساب رؤى أحدث حول الفيزيولوجيا المرضية لأشكال مختلفة من ضمور الشبكية الموروث. تم وصف العديد من البروتوكولا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالدعم العلمي والتقني من الدكتورة شيترا كانابيران ، عالمة الوراثة. د. سوبهادرا جلالي، استشاري الشبكية. الدكتور ميليند ، جراح تجميل العين. والدكتور سواثي كاليكي ، أخصائي أورام العين في معهد LV Prasad للعيون ، حيدر أباد نحو توليد خطوط iPSC طبيعية ومحددة للمريض. يقر المؤلفون بمنح البحث والتطوير من مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، قسم العلوم والتكنولوجيا (IM) ، (SB / SO / HS / 177/2013) ، قسم التكنولوجيا الحيوية (IM) ، (BT / PR32404 / MED / 30/2136/2019) ، وزمالات بحثية عليا من ICMR (S.M. ، D.P.) ، UGC (T.A.) ، و CSIR (V.K.P.) ، حكومة الهند.
Materials
| 0.22 µm Syringe filters | TPP | 99722 | |
| 15 mL centrifuge tube | TPP | 91015 | |
| 50 mL centrifuge tube | TPP | 91050 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| Anti-Chx10 Antibody; Mouse monoclonal | Santa Cruz | SC365519 | 1:50 dilution |
| Anti-CRX antibody; Rabbit monoclonal | Abcam | ab140603 | 1:300 dilution |
| Anti-MiTF antibody, Mouse monoclonal | Abcam | ab3201 | 1:250 dilution |
| Anti-Recoverin Antibody; Rabbit polyclonal | Millipore | AB5585 | 1:300 dilution |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher | 17504044 | |
| Basic Fibroblast growth factor (bFGF) | Sigma Aldrich | F0291 | |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Coplin Jar (50 mL) | Tarson | ||
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| CryoTubes | Thermo Fisher | V7884 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement (basal medium) | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| DreamTaq DNA polymerase | Thermo Fisher | EP0709 | |
| Dulbeco’s Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 14190144 | |
| Essential 8 medium kit | Thermo Fisher | A1517001 | |
| Ethylene diamine tetraaceticacid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Falcon Not TC-treated Treated Petri Dish, 60 mm | Corning | 351007 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, United States | Gibco | 26140079 | |
| GelDocXR+ with Image lab software | BIO-RAD | Agarose Gel documentation system | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11030 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Alexa Fluo 546 | Invitrogen | A11035 | 1:300 dilution |
| Goat anti-Rabbit- IgG (H+L), Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | 1:300 dilution |
| HistoCore MULTICUT | Leica | For sectioning | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Acsorbic acid | Sigma Aldrich | A92902 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140-050 | |
| N2 supplement (100x) | Thermo Fisher | 17502048 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | To quantify RNA | |
| Paraformaldehyde | Qualigens | 23995 | |
| Pasteur Pipets, 9 inch, Non-Sterile, Unplugged | Corning | 7095D-9 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher | 15140-122 | |
| Recombinant Anti-Otx2 antibody , Rabbit monoclonal | Abcam | ab183951 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-PAX6 antibody; Rabbit Monoclonal | Abcam | ab195045 | 1:300 dilution |
| Recombinant Anti-RPE65 antibody, Rabbit Monoclonal | Abcam | ab231782 | 1:300 dilution |
| Recombinant Human Noggin Protein | R&D Systems | 6057-NG | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Serological pipettes 10 mL | TPP | 94010 | |
| Serological pipettes 5 mL | TPP | 94005 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Sodium Citrate Tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | S4641 | |
| Starfrost (silane coated) microscopic slides | Knittel | ||
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | Thermo Fisher | 18080051 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR | Invitrogen | 18080051 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector laboratories | H-1200 | |
| Vitronectin | Thermo Fisher | A27940 | |
| Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | Confocal microscope |
Referências
- Dandona, R., et al. Moderate visual impairment in India: the Andhra Pradesh Eye Disease Study. British Journal of Ophthalmology. 86 (4), 373-377 (2002).
- Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. Retinitis pigmentosa. Lancet. 368 (9549), 1795-1809 (2006).
- Sen, P., et al. Prevalence of retinitis pigmentosa in South Indian population aged above 40 years. Ophthalmic Epidemiology. 15 (4), 279-281 (2008).
- Nazimul, H., Rohit, K., Anjli, H. Trend of retinal diseases in developing countries. Expert Review of Ophthalmology. 3 (1), 43-50 (2008).
- . RetNet – Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet/ (2022)
- Cicero, S. A., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (16), 6685-6690 (2009).
- Guo, Y., et al. Modeling retinitis pigmentosa: retinal organoids generated from the iPSCs of a patient with the USH2A mutation show early developmental abnormalities. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 361 (2019).
- Lane, A., et al. Modeling and rescue of RP2 Retinitis pigmentosa using iPSC-derived retinal organoids. Stem Cell Reports. 15 (1), 67-79 (2020).
- Li, Y. P., Deng, W. L., Jin, Z. B. Modeling retinitis pigmentosa through patient-derived retinal organoids. STAR Protocols. 2 (2), 100438 (2021).
- Gonzalez-Cordero, A., et al. Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors. Stem Cell Reports. 9 (3), 820-837 (2017).
- Meyer, J. S., et al. Optic vesicle-like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells. 29 (8), 1206-1218 (2011).
- Zhu, J., Lamba, D. A. Small molecule-based retinal differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells. Bio-Protocol. 8 (12), 2882 (2018).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Chichagova, V., et al. Differentiation of retinal organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 50 (1), 95 (2019).
- Kelley, R. A., Chen, H. Y., Swaroop, A., Li, T. Accelerated development of rod photoreceptors in retinal organoids derived from human pluripotent stem cells by supplementation with 9-cis retinal. STAR Protocols. 1 (1), 100033 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Mellough, C. B., et al. IGF-1 signaling plays an important role in the formation of three-dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells. Stem Cells. 33 (8), 2416-2430 (2015).
- Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
