Die Netzhaut ist ein lichtempfindliches Gewebe im hinteren Teil des Wirbeltierauges, das Lichtsignale durch ein biochemisches Phänomen, das als Phototransduktionsweg bekannt ist, in Nervenimpulse umwandelt. Die anfänglichen Nervenimpulse, die in den Photorezeptorzellen der Netzhaut erzeugt werden, werden an andere retinale Interneuronen und retinale Ganglienzellen (RGCs) weitergeleitet und erreichen den visuellen Kortex des Gehirns, was bei der Bildwahrnehmung und der visuellen Reaktion hilft.

Nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation (WHO) sind schätzungsweise 1,5 Millionen Kinder blind, davon 1 Million in Asien. Die erbliche Netzhautdystrophie (IRD) ist eine schwere Erblindungserkrankung, von der weltweit 1 von 4.000 Personen betroffen ist ^1,2,3, während die Prävalenz der Erblindung im Zusammenhang mit altersbedingter Makuladegeneration (AMD) in Entwicklungsländern zwischen 0,6 % und ^1,1 % liegt ⁴. IRDs werden durch vererbte genetische Defekte in über 300 verschiedenen Genen verursacht, die an der Entwicklung und Funktion der Netzhaut beteiligt sind⁵. Solche genetischen Veränderungen führen zu einer Störung der normalen Netzhautfunktionen und einer allmählichen Degeneration der Netzhautzellen, nämlich der Photorezeptorzellen und des retinalen Pigmentepithels (RPE), was zu schwerem Sehverlust und Erblindung führt. Enorme Fortschritte wurden bei anderen Erblindungszuständen erzielt, die die Hornhaut, die Linse usw. betreffen. Für Netzhautdystrophien und Sehnervenatrophien gibt es bisher jedoch keine bewährte Therapie. Da eine erwachsene menschliche Netzhaut keine Stammzellen^{besitzt 6}, können alternative Quellen wie embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und patienteneigene induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) einen unbegrenzten Vorrat an gewünschten Zelltypen bereitstellen und sind vielversprechend für die Entwicklung komplexer Gewebeorganoide, die für In-vitro-Studien zur Modellierung von Krankheiten und für die Entwicklung regenerativer Therapien erforderlich sind^{7. 8,9,10}.

Mehrere Jahre Netzhautforschung haben zu einem besseren Verständnis der molekularen Ereignisse geführt, die die frühe Entwicklung der Netzhaut orchestrieren. Die meisten Protokolle zur Erzeugung von Netzhautzellen und 3D-Organoiden aus PSCs zielen darauf ab, diese Entwicklungsereignisse in vitro zu rekapitulieren, indem die Zellen in einem komplexen Cocktail aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen kultiviert werden, um die bekannten biologischen Prozesse schrittweise zu modulieren. Die so erzeugten retinalen Organoide bestehen aus den wichtigsten Netzhautzellen: retinalen Ganglienzellen (RGCs), Interneuronen, Photorezeptoren und retinalem pigmentiertem Epithel (RPE)11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Trotz erfolgreicher Versuche, IRDs mit retinalen Organoiden zu modellieren, stellt die Notwendigkeit des komplexen Cocktails aus Wachstumsfaktoren und kleinen Molekülen während der Differenzierung und die relativ geringe Effizienz der retinalen Organoidgenerierung eine große Herausforderung für die meisten Protokolle dar. Sie beinhalten hauptsächlich die Bildung von Embryoidkörpern, gefolgt von ihrer schrittweisen Differenzierung in retinale Linien unter Verwendung komplexer Kulturbedingungen in verschiedenen Stadien der In-vitro-Entwicklung ^20,21,22.

In dieser Arbeit wird über eine vereinfachte und robuste Methode zur Entwicklung komplexer 3D-Neuro-Retina-Organoide aus gesunden Kontroll- und Netzhauterkrankungs-spezifischen hiPS-Zellen berichtet. Das hier beschriebene Protokoll nutzt die direkte Differenzierung von nahezu konfluenten hiPSC-Kulturen, ohne dass eine Embryoidkörperbildung erforderlich ist. Außerdem wird die Komplexität des Nährmediums vereinfacht, was es zu einer kostengünstigen und reproduzierbaren Technik macht, die von neuen Forschern leicht übernommen werden kann. Es handelt sich um ein hybrides Kultursystem, das aus adhärenten Monolayer-Kulturen während der ersten 4 Wochen der Netzhautdifferenzierung bis zur Entstehung von ausgeprägten, selbstorganisierten Augenfeld-Primordial-Clustern (EFPs) besteht. Darüber hinaus werden die zirkulären neuro-retinalen Inseln innerhalb jedes EFP manuell gepflückt und für 1-2 Wochen in Suspensionskulturen gezüchtet, um mehrschichtige 3D-Netzhautschalen oder Organoide herzustellen, die aus PAX6+ und CHX10⁺ proliferierenden neuroretinalen Vorläufern bestehen. Eine ausgedehnte Kultivierung von retinalen Organoiden in 100 μM taurinhaltigem Medium für weitere 4 Wochen führte zur Entstehung von RCVRN+ und CRX⁺ Photorezeptorvorläufern und reifen Zellen mit rudimentären inneren segmentartigen Fortsätzen.