Kompostmikrokosmos bringer den mikrobielle mangfoldighed, der findes i naturen, ind i laboratoriet for at lette mikrobiomforskning i Caenorhabditis elegans. Forudsat her er protokoller til opsætning af mikrokosmoseksperimenter, hvor eksperimenterne demonstrerer evnen til at modulere miljømikrobiel mangfoldighed for at udforske forholdet mellem miljømikrobiel mangfoldighed og ormgutmikrobiomsammensætning.
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig model til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner mellem værter og deres tarmmikrobiomer. Mens eksperimenter med velkarakteriserede bakterier eller definerede bakteriesamfund kan lette analysen af molekylære mekanismer, er det vigtigt at studere nematoder i deres naturlige mikrobielle sammenhæng for at udforske mangfoldigheden af sådanne mekanismer. Samtidig er isolering af orme fra naturen ikke altid mulig, og selv når det er muligt, begrænser prøveudtagning fra naturen brugen af det genetiske værktøjssæt, der ellers er tilgængeligt til C. elegans-forskning. Følgende protokol beskriver en metode til mikrobiomundersøgelser, der anvender kompostmikrokosmos til vækst i laboratoriet i mikrobielt forskellige og naturlignende miljøer.
Lokalt fremskaffet jord kan beriges med produkter for at diversificere de mikrobielle samfund, hvor orme opdrættes, og hvorfra de høstes, vaskes og overfladesteriliseres til efterfølgende analyser. Repræsentative eksperimenter demonstrerer evnen til at modulere det mikrobielle samfund i en fælles jord ved at berige det med forskellige produkter og yderligere demonstrere, at orme opdrættet i disse forskellige miljøer samler lignende tarmmikrobiomer, der adskiller sig fra deres respektive miljøer, hvilket understøtter forestillingen om et artsspecifikt kernetarmmikrobiom. Samlet set giver kompostmikrokosmos naturlige miljøer i laboratoriet til mikrobiomforskning som et alternativ til syntetiske mikrobielle samfund eller til isolering af vilde nematoder.
Nematoden Caenorhabditis elegans fremstår som en nyttig model til undersøgelse af interaktioner mellem værter og deres tarmmikrobiomer 1,2. Som model giver det flere fordele. For det første er kimfrie eller gnotobiotiske dyr lette at opnå og vedligeholde; blegemiddel kan bruges til at dræbe gravide orme og tilhørende mikrober, hvilket efterlader deres blegemiddelresistente æg uskadte til at vokse som alderssynkroniserede populationer, der kan koloniseres af bakterier af interesse 3,4. Hertil kommer, at når de dyrkes i nærværelse af bakterier, indtager C. elegans, en bakterie, de stødte bakterier, med modtagelige arter fordøjet eller udskilt, mens resistente og vedholdende arter stabilt koloniserer ormens tarm. Desuden er C. elegans for det meste hermafroditiske, der producerer populationer af genetisk identiske afkom, hvilket reducerer forvirrende genetisk variation. Sammen med tilgængeligheden af mutante og transgene ormestammer tilbyder arbejdet med C. elegans forskere en gnotobiotisk og genetisk medgørlig model til at undersøge det molekylære grundlag for værtsmikrobeinteraktioner 5,6,7,8.
Mens eksperimenter med velkarakteriserede bakterier kan lette analysen af molekylære mekanismer, er identifikation og undersøgelse af de bakterier, som orme interagerer med i naturen, afgørende for at udforske mangfoldigheden af sådanne mekanismer, optrævle den naturlige kontekst for deres funktion og forstå de selektive kræfter, der har formet deres udvikling. Uden for laboratoriet findes C. elegans globalt i fugtige tempererede klimaer, hvor befolkninger menes at gennemgå en “boom-and-bust” livscyklus, præget af hurtig befolkningstilvækst, når ressourcerne er rigelige, efterfulgt af et udviklingsmæssigt skift til banebrydende, stresstolerante dauers, når ressourcerne er udtømt9. Selvom det betragtes som en jordnematode, findes vildtvoksende C. elegans-populationer oftest fodring af nedbrydende organisk materiale såsom rådne blomster eller frugter, hvor bakteriepopulationer er rigelige og forskellige.
Undersøgelser af tarmmikrobiomet i nematoder isoleret fra naturen har identificeret forskellige, men karakteristiske bakteriesamfund 10,11, hvis sammensætning yderligere blev understøttet af undersøgelser udført med orme opdrættet i naturlignende mikrokosmosmiljøer 12,13. Sammen muliggjorde sådanne undersøgelser afgrænsningen af et kerneormtarmmikrobiom2. Mens prøveudtagningen af C. elegans-populationer i naturen repræsenterer den mest direkte undersøgelse af naturlige orme-mikrobe-interaktioner, er det ikke muligt overalt og når som helst, da det er begrænset til regioner og årstider med rigelig nedbør10,11. Alternativt, i stedet for at isolere orme fra deres naturlige habitat, bringer eksperimenter ved hjælp af mikrokosmos det naturlige habitat ind i laboratoriet 6,8,12,13,14,15. Mikrokosmos miljøer er forberedt af jord komposteret med forskellige frugter eller grøntsager, hvilket muliggør yderligere diversificering af startjordsamfundet. De tilbyder medgørlige eksperimentelle metoder, der kombinerer den mikrobielle mangfoldighed og det tredimensionelle vilde jordmiljø med de eksperimentelle fordele ved et kontrolleret laboratorieanlæg og genetisk definerede ormestammer. Protokollen nedenfor beskriver de trin, der er involveret i arbejdet med kompostmikrokosmos, og demonstrerer deres anvendelse til at forstå samlingen af et karakteristisk ormtarmmikrobiom fra forskellige miljøer.
Protokollen, der præsenteres her, beskriver en metode til at studere tarmmikrobiomet af nematoder opdrættet i naturlignende miljøer, der tilbyder en alternativ tilgang til isolering af orme fra naturen eller til at opdrætte dem på syntetiske samfund.
De tusindvis af potentielle bakteriearter, der er fanget i det repræsentative mikrokosmoseksperiment, afspejler den mikrobielle mangfoldighed, som ormene har udviklet sig med, og demonstrerer mikrokosmosrørledningens evne til at kombinere fordelene ved at arbejde med en modelværtsorganisme og fordelene ved at arbejde med naturlige, forskellige mikrobielle samfund.
De repræsentative resultater viser, at berigelse af en fælles jordbund med forskellige produkttyper modulerer den mikrobielle mangfoldighed i miljøet og fremhæver den vifte af mikrobiel mangfoldighed, der er tilgængelig til udforskning ved hjælp af denne rørledning. Produktvalg er ikke særlig vigtigt. Tidligere arbejde har brugt bananer, æbler, appelsiner, jordbær, grønne teblade og kartofler til at berige jorden, hvilket resulterer i lignende orm, der øger effektiviteten. Blandede produkter er også blevet brugt effektivt. Nøglefunktionen er, at forskellige produkter vil diversificere en given jord på forskellige måder.
På trods af den brede variation i miljømæssig mikrobiel mangfoldighed varierer ormgutmikrobiomer betydeligt mindre, hvilket rekapitulerer betydningen af ormens tarmniche og værtsfiltrering til samling af et kernetarmmikrobiom, der adskiller sig fra dets jordmiljø13. Dette mønster observeres bedst med vægtet UniFrac PCoA-analyse, der viser, at forskellene mellem miljøjord og ormetarmmikrobiomer hovedsagelig stammer fra forskelle i den relative overflod af nøgletaxa.
Selvom protokollen beskrevet her fokuserer på høst af orme til 16S-sekventering, kan mikrokosmos bruges til at udforske yderligere spørgsmål af interesse. For eksempel kan orme høstet fra mikrokosmos efterfølgende undersøges for effekten af et forskelligt tarmmikrobiom på værtsresistens over for forskellige ugunstige forhold, herunder patogener eller toksiner. Alternativt kan nye bakteriearter og stammer isoleres og dyrkes fra jordhøstede orme, hvilket udvider den taksonomiske og funktionelle mangfoldighed af bakterier, der er tilgængelige til at udføre eksperimenter med.
Mens forskningsmetoder i laboratorieindstillinger søger konsistens og reproducerbarhed, udnytter arbejde med mikrokosmos den naturlige variation til at udforske værtsmikrobeinteraktioner i en naturlignende sammenhæng. Ikke desto mindre giver denne variation også nogle udfordringer. Nogle jordarter, der omfatter høje niveauer af endogene hvirvelløse dyr, kan kræve yderligere centrifugering, filtrering og undersøgelsestrin for effektivt at eliminere uønskede organismer fra mikrokosmospræparatet. Derudover kan lav mikrobiel overflod i jord fremkalde uønsket dauerdannelse i ormpopulationer, hvilket kræver en stigning i mikrobielt ekstrakt eller berigelse af jord med en større mængde produkter. Med hvert mikrokosmoseksperiment, der udføres, fortsætter forskerne med at udforske den fulde taksonomiske og funktionelle mangfoldighed, der leveres af naturen, hvilket muliggør opdagelsen af nye mikrobielle taxa og funktionelle evner lige fra infektionsresistens til beskyttelse mod miljøfremmede xenobiotika.
The authors have nothing to disclose.
Det arbejde, der er beskrevet i dette manuskript, blev støttet af NIH-tilskud R01OD024780 og R01AG061302. K.T. blev yderligere støttet af et Summer Undergraduate Research Fellowship fra University of California, Berkeley, finansieret af Rose Hills Foundation. Tegneseriedesign i figur 1 blev hentet fra BioRender.com.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |