Kompost mikrokozmosları, Caenorhabditis elegans’ta mikrobiyom araştırmalarını kolaylaştırmak için doğada bulunan mikrobiyal çeşitliliği laboratuvara getirir. Burada, çevresel mikrobiyal çeşitlilik ile solucan bağırsak mikrobiyom bileşimi arasındaki ilişkileri keşfetmek için çevresel mikrobiyal çeşitliliği modüle etme yeteneğini gösteren deneylerle mikrokozmos deneyleri kurmak için protokoller verilmiştir.
Nematod Caenorhabditis elegans, konakçılar ve bağırsak mikrobiyomları arasındaki etkileşimlerin altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için yararlı bir model olarak ortaya çıkmaktadır. İyi karakterize edilmiş bakteriler veya tanımlanmış bakteri toplulukları ile yapılan deneyler moleküler mekanizmaların analizini kolaylaştırabilirken, nematodları doğal mikrobiyal bağlamlarında incelemek, bu tür mekanizmaların çeşitliliğini keşfetmek için gereklidir. Aynı zamanda, solucanların vahşi doğadan izole edilmesi her zaman mümkün değildir ve mümkün olduğunda bile, vahşi doğadan örnekleme, C. elegans araştırması için mevcut olan genetik araç setinin kullanımını kısıtlar. Aşağıdaki protokol, mikrobiyal olarak çeşitli ve doğal benzeri ortamlarda laboratuvar içi büyüme için kompost mikrokozmosları kullanan mikrobiyom çalışmaları için bir yöntemi açıklamaktadır.
Yerel kaynaklı toprak, solucanların yetiştirildiği ve daha sonraki analizler için hasat edildikleri, yıkandıkları ve yüzey sterilize edildikleri mikrobiyal toplulukları çeşitlendirmek için ürünlerle zenginleştirilebilir. Temsili deneyler, mikrobiyal topluluğu farklı ürünlerle zenginleştirerek ortak bir toprakta modüle etme yeteneğini göstermektedir ve ayrıca bu farklı ortamlarda yetiştirilen solucanların, kendi çevrelerinden farklı benzer bağırsak mikrobiyomlarını bir araya getirdiğini ve türe özgü bir çekirdek bağırsak mikrobiyomu kavramını desteklediğini göstermektedir. Genel olarak, kompost mikrokozmosları, sentetik mikrobiyal topluluklara veya vahşi nematodların izolasyonuna alternatif olarak mikrobiyom araştırmaları için doğal benzeri laboratuvar içi ortamlar sağlar.
Nematod Caenorhabditis elegans, konakçılar ve bağırsak mikrobiyomları arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı bir model olarak ortaya çıkmaktadır 1,2. Bir model olarak, çeşitli avantajlar sunar. İlk olarak, mikropsuz veya gnotobiyotik hayvanların elde edilmesi ve bakımı kolaydır; Ağartıcı, gravid solucanları ve ilişkili mikropları öldürmek için kullanılabilir, ağartmaya dirençli yumurtalarını, ilgilenilen bakteriler tarafından kolonize edilebilen yaş senkronize popülasyonlar olarak büyümek için zarar görmeden bırakır 3,4. Ek olarak, bakteri varlığında yetiştirildiğinde, bir bakteri olan C. elegans, karşılaşılan bakterileri, sindirilen veya atılan duyarlı türlerle yutarken, dirençli ve kalıcı türler solucan bağırsağını kararlı bir şekilde kolonize eder. Dahası, C. elegans çoğunlukla hermafroditiktir ve genetik olarak aynı soy popülasyonlarını üretir, bu da kafa karıştırıcı genetik çeşitliliği azaltır. Mutant ve transgenik solucan suşlarının mevcudiyeti ile birleştiğinde, C. elegans ile çalışmak, araştırmacılara konakçı-mikrop etkileşimlerinin moleküler temellerini araştırmak için gnotobiyotik ve genetik olarak izlenebilir bir model sunar 5,6,7,8.
İyi karakterize edilmiş bakterilerle yapılan deneyler moleküler mekanizmaların analizini kolaylaştırabilirken, solucanların doğada etkileşime girdiği bakterileri tanımlamak ve incelemek, bu tür mekanizmaların çeşitliliğini keşfetmek, işlevleri için doğal bağlamı çözmek ve evrimlerini şekillendiren seçici güçleri anlamak için gereklidir. Laboratuvarın dışında, C. elegans küresel olarak nemli ılıman iklimlerde bulunur; burada popülasyonların, kaynaklar bol olduğunda hızlı nüfus artışı ile karakterize edilen “patlama ve büst” yaşam döngüsünden geçtiği düşünülür, ardından kaynaklar tükendiğinde öncü, strese dayanıklı dauer’lere gelişimsel bir kayma9. Bir toprak nematodu olarak kabul edilmesine rağmen, vahşi çoğalan C. elegans popülasyonları en yaygın olarak, bakteri popülasyonlarının bol ve çeşitli olduğu çürüyen çiçekler veya meyveler gibi ayrışan organik materyallerle beslenir.
Vahşi doğadan izole edilen nematodlardaki bağırsak mikrobiyomunun çalışmaları, bileşimi doğal benzeri mikrokozmos ortamlarında yetiştirilen solucanlarla yapılan çalışmalarla daha da desteklenen çeşitli ancak karakteristik bakteri toplulukları10,11 tanımlamıştır12,13. Birlikte, bu tür çalışmalar bir çekirdek solucan bağırsak mikrobiyomunun tanımlanmasını sağladı2. C. elegans popülasyonlarının vahşi doğada örneklenmesi, doğal solucan-mikrop etkileşimlerinin en doğrudan incelemesini temsil ederken, bol yağışlı bölgeler ve mevsimlerle sınırlı olduğu için her yerde ve her zaman mümkün değildir.10,11. Alternatif olarak, solucanları doğal ortamlarından izole etmek yerine, mikrokozmoslar kullanılarak yapılan deneyler, doğal yaşam alanınılaboratuvara getirir 6,8,12,13,14,15. Mikrokozmos ortamları, çeşitli meyve veya sebzelerle kompostlanmış topraktan hazırlanır ve bu da başlangıç toprak topluluğunun daha da çeşitlendirilmesini sağlar. Mikrobiyal çeşitliliği ve üç boyutlu vahşi toprak ortamını, kontrollü bir laboratuvar tesisinin ve genetik olarak tanımlanmış solucan suşlarının deneysel avantajlarıyla birleştiren izlenebilir deneysel yöntemler sunarlar. Aşağıdaki protokol, kompost mikrokozmosları ile çalışmanın adımlarını detaylandırarak, çeşitli ortamlardan karakteristik bir solucan bağırsak mikrobiyomunun montajını anlamada kullanımlarını göstermektedir.
Burada sunulan protokol, doğal benzeri ortamlarda yetiştirilen nematodların bağırsak mikrobiyomunu incelemek için bir yöntem açıklamakta ve solucanların doğadan izole edilmesine veya sentetik topluluklarda yetiştirilmesine alternatif bir yaklaşım sunmaktadır.
Temsili mikrokozmos deneyinde yakalanan binlerce potansiyel bakteri türü, solucanların evrimleştiği mikrobiyal çeşitliliği yansıtır ve mikrokozmos boru hattının, model bir konakçı organizma ile çalışmanın avantajlarını ve doğal, çeşitli mikrobiyal topluluklarla çalışmanın avantajlarını birleştirme yeteneğini gösterir.
Temsili sonuçlar, ortak bir toprağı farklı ürün türleriyle zenginleştirmenin çevresel mikrobiyal çeşitliliği modüle ettiğini ve bu boru hattını kullanarak keşif için mevcut mikrobiyal çeşitlilik aralığını vurguladığını göstermektedir. Üretim seçimi özellikle önemli değildir. Önceki çalışmalar, toprağı zenginleştirmek için muz, elma, portakal, çilek, yeşil çay yaprakları ve patates kullandı ve bu da benzer solucanların verimliliği artırmasına neden oldu. Karışık ürünler de etkili bir şekilde kullanılmıştır. Temel özellik, farklı ürünlerin belirli bir toprağı farklı şekillerde çeşitlendirmesidir.
Çevresel mikrobiyal çeşitlilikteki geniş varyasyona rağmen, solucan bağırsağı mikrobiyomları önemli ölçüde daha az farklılık gösterir, bu da solucan bağırsak nişinin önemini ve toprak ortamınınkinden farklı bir çekirdek bağırsak mikrobiyomunun montajı için konakçı filtrelemesini özetler13. Bu model en iyi ağırlıklı UniFrac PCoA analizi ile gözlemlenir ve çevresel toprak ile solucan bağırsak mikrobiyomları arasındaki farklılıkların çoğunlukla anahtar taksonların göreceli bolluğundaki farklılıklardan kaynaklandığını gösterir.
Burada açıklanan protokol, 16S dizilimi için solucanların toplanmasına odaklansa da, mikrokozmoslar ilgi çekici ek soruları araştırmak için kullanılabilir. Örneğin, mikrokozmoslardan toplanan solucanlar daha sonra çeşitli bağırsak mikrobiyomunun patojenler veya toksinler de dahil olmak üzere çeşitli olumsuz koşullara karşı konakçı direnci üzerindeki etkisi açısından incelenebilir. Alternatif olarak, yeni bakteri türleri ve suşları, yerden hasat edilmiş solucanlardan izole edilebilir ve kültürlenebilir, bu da deneyler yapmak için mevcut bakterilerin taksonomik ve fonksiyonel çeşitliliğini genişletir.
Laboratuvar ortamlarındaki araştırma yöntemleri tutarlılık ve tekrarlanabilirlik ararken, mikrokozmoslarla çalışmak, konakçı-mikrop etkileşimlerini doğal benzeri bir bağlamda keşfetmek için doğal varyasyondan yararlanır. Bununla birlikte, bu varyasyon da bazı zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Yüksek düzeyde endojen omurgasızlar içeren bazı topraklar, istenmeyen organizmaları mikrokozmos preparatından etkili bir şekilde ortadan kaldırmak için ek santrifüjleme, filtreleme ve inceleme adımları gerektirebilir. Ek olarak, topraktaki düşük mikrobiyal bolluk, solucan popülasyonlarında istenmeyen dauer oluşumuna neden olabilir, bu da mikrobiyal ekstraktta bir artış gerektirebilir veya toprağı daha fazla miktarda ürünle zenginleştirebilir. Yapılan her mikrokozmos deneyi ile araştırmacılar, doğanın sağladığı tüm taksonomik ve fonksiyonel çeşitliliği keşfetmeye devam ederek, enfeksiyon direncinden çevresel ksenobiyotiklere karşı korunmaya kadar değişen yeni mikrobiyal taksonların ve fonksiyonel yeteneklerin keşfedilmesini sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Bu makalede açıklanan çalışma, NIH hibeleri R01OD024780 ve R01AG061302 tarafından desteklenmiştir. K.T. ayrıca, Rose Hills Vakfı tarafından finanse edilen Kaliforniya Üniversitesi, Berkeley’den bir Yaz Lisans Araştırma Bursu tarafından desteklendi. Şekil 1’deki karikatür tasarımları BioRender.com’dan elde edilmiştir.
AMPure XP Reagent, 60 mL | Beckman Coulter | A63881 | Supplementary File Step 1.3 |
Bleach (Sodium Hypochlorite) | Sigma-Aldrich | 7681-52-9 | Step 6.5 |
DNeasy PowerSoil Pro Kit | Qiagen | 47016 | Step 7 DNA extractions |
dNTP set 10 mM | Invitrogen | 18427013 | Supplementary Step 1.2 |
Easypet 3 Serological Pipette Controller | Eppendorf | 4430000018 | Used to remove supernatant when specified |
Greiner Bio-One 25 mL Sterile Serological Pipets | Fisher Scientific | 07-000-368 | Used to remove supernatant when specified |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | Used to make M9 |
Levamisole Hydrochloride | Fisher Scientific | AC187870100 | Step 6.4 |
M9 Minimal Media Solution | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
MgSO4 | Fisher Scientific | M63-500 | Used to make M9 |
MiniSeq High Output Reagent Kit (150 cycles) | Illumina | FC-420-1002 | Supplementary Step 1.7 |
MiniSeq System | Illumina | SY-420-1001 | Commercial sequencer used; Supplementary Step 1.7 |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | Used to make M9 |
NaCl | Fisher Scientific | S271-3 | Used to make M9 |
Nematode Growth Media (NGM) | Prepared in-house | N/A | Recipe in wormbook.org |
Nextera XT DNA Library Preparation Kit (96 samples) | Illumina | FC-131-1096 | Library prep kit used; Supplementary Step 1.4 |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Supplementary Step 1.7 |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | Supplementary Step 1.2 |
PowerLyzer 24 Homogenizer (110/220 V) | Qiagen | 13155 | Step 7.3 |
Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32851 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33238 | Supplementary Steps 1.1 & 1.6 |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP-151 | Used to prepare M9+T |
Zirconia/Silica Beads 1.0 mm diameter | Fisher Scientific | NC9847287 | Step 7.1 |