Erytropoies kan delas in i två huvudfaser: tidig erytropoies och erytroid terminal differentiering (figur 1)^1,2,3. Vid tidig erytropoies förbinder sig hematopoetiska stamceller till erytroidlinjen och ger upphov till tidiga erytroidförfäder, som först identifierades på 1970-talet baserat på deras kolonibildande potential i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stort sett är erytroidförfäder indelade i två kategorier: tidigare förfäder som var och en ger upphov till en “burst” (ett stort aggregat av mindre erytroidcellkluster), namngivna “burst-forming unit erythroid” eller BFU-e ^4,5,6; och deras avkomma, som var och en bildar ett enda, litet erytroidcellkluster eller koloni, som heter “kolonibildande enhet erytroid” eller CFU-e ^7,8,9. BFU-e och CFU-e uttrycker ännu inte terminala erytroidgener och är inte morfologiskt igenkännliga. Efter ett antal självförnyelse- eller expansionscelldelningar genomgår CFU-e en transkriptionsomkopplare där erytroidgener såsom globiner induceras och därigenom övergår till erytroidterminal differentiering (ETD)^1,10. Under ETD genomgår erytroblaster tre till fem mognadscelldelningar innan de enucleated för att bilda retikulocyter, som mognar till röda blodkroppar.

Erytroblaster under terminal differentiering klassificerades ursprungligen baserat på deras morfologi till proerytroblaster, basofila, polykromatiska och ortokromatiska. Tillkomsten av flödescytometri möjliggjorde deras prospektiva sortering och isolering baserat på cellstorlek (mätt med framåtspridning, FSC) och två cellytmarkörer, CD71 och Ter119^11,12,13 (figur 1). Detta och liknande flödescytometriska tillvägagångssätt¹⁴ har revolutionerat undersökningen av de molekylära och cellulära aspekterna av ETD, vilket möjliggör utvecklingsstegspecifik analys av erytroblaster in vivo och in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-metoden används nu rutinmässigt vid analys av erytroidprekursorer.

Fram till nyligen har ett liknande, tillgängligt flödescytometriskt tillvägagångssätt för direkt, prospektiv isolering av CFU-e och BFU-e från musvävnad med hög renhet gäckat utredare. Istället har utredare använt flödescytometriska strategier som isolerar endast en bråkdel av dessa förfäder, ofta i närvaro av icke-erytroida celler som samrenar inom samma flödescytometriska delmängder²¹. Följaktligen begränsades undersökningen av BFU-e och CFU-e till in vitro-differentieringssystem som härleder och förstärker BFU-e och CFU-e från tidigare benmärgsförfäder. Det är sedan möjligt att tillämpa flödescytometriska strategier som skiljer CFU-e från BFU-e i dessa erytroida stamfaderberikade kulturer^22,23. Ett alternativt tillvägagångssätt använder sig av fostrets CFU-e och BFU-e, som är mycket berikade i den Ter119-negativa fraktionen av musfostrets lever vid mitten av graviditeten 10,24,25. Inget av dessa tillvägagångssätt tillåter dock undersökning av vuxen BFU-e och CFU-e i deras fysiologiska tillstånd in vivo. Utmaningens storlek kan uppskattas när man påminner om att dessa celler, baserat på kolonibildningsanalyser, finns i den vuxna benmärgen med en frekvens av endast 0,025% respektive 0,3%^6.

Protokollet som beskrivs här är ett nytt flödescytometriskt tillvägagångssätt baserat på encells transkriptomisk analys av nyskördade Kit ⁺ musbenmärgsceller (Kit uttrycks av alla tidiga stampopulationer i benmärgen)¹. Vårt tillvägagångssätt innehåller några cellytmarkörer som redan användes av Pronk et ^al.21,26. Encelliga transkriptom användes för att bestämma kombinationer av cellytmarkörer som identifierar erytroid och andra tidiga hematopoetiska förfäder (figur 2). Specifikt kan CD55 + –fraktionen av härstamningsnegativa (Lin-) Kit ^{+ –}celler delas in i fem populationer, varav tre ger sammanhängande segment av erytroidbanan (figur 2). De transkriptomiska identiteterna för var och en av dessa populationer bekräftades genom sortering, följt av scRNAseq och projektion av de sorterade encelliga transkriptomerna tillbaka till den ursprungliga transkriptomiska kartan (genuttrycket i var och en av de fem populationerna och hela benmärgsdatasetet kan utforskas i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Cellens ödespotential för var och en av populationerna bekräftades med hjälp av traditionella kolonibildningsanalyser (figur 2), liksom en ny högkapacitetsanalys av encells öde ^1,27. Dessa analyser visar att det nya flödescytometriska tillvägagångssättet resulterar i isolering med hög renhet av alla BFU-e- och CFU-e-förfäder av färsk vuxen benmärg och mjälte. Specifikt innehåller population 1 (P1) endast CFU-e och inga andra hematopoetiska stamfäder, och population 2 (P2) innehåller alla benmärgens BFU-e-stamfäder och ett litet antal CFU-e men inga andra föregångare¹. Det detaljerade protokollet nedan illustreras ytterligare med ett exempelexperiment på möss som injicerades med antingen saltlösning eller med det erytropoiesstimulerande hormonet erytropoietin (Epo).