Summary

Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

Published: November 04, 2022
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Summary

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Abstract

Los progenitores eritroides tempranos se definieron originalmente por su potencial de formación de colonias in vitro y se clasificaron en “unidades” formadoras de ráfagas y colonias conocidas como BFU-e y UFC-e. Hasta hace poco, no se disponía de métodos para el aislamiento prospectivo directo y completo de progenitores puros de BFU-e y UFC-e de médula ósea de ratón adulta recién aislada. Para abordar esta brecha, se analizó un conjunto de datos de RNA-seq de una sola célula (scRNAseq) de médula ósea de ratón para la expresión de genes que codifican marcadores de superficie celular. Este análisis se combinó con ensayos de destino celular, lo que permitió el desarrollo de un nuevo enfoque citométrico de flujo que identifica y permite el aislamiento de subconjuntos completos y puros de progenitores BFU-e y CFU-e en médula ósea o bazo de ratón. Este enfoque también identifica otros subconjuntos progenitores, incluidos los subconjuntos enriquecidos para los potenciales basófilos/mastocitos y megacariocíticos. El método consiste en marcar células frescas de médula ósea o bazo con anticuerpos dirigidos a Kit y CD55. Los progenitores que expresan ambos marcadores se subdividen en cinco poblaciones principales. La población 1 (P1 o UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/bajo CD105 med/alto CD71 med/alto) contiene todos los progenitores CFU-e y puede subdividirse en P1-bajo (CD71 med CD150 alto) y P1-hi (CD71alto CD150 bajo), correspondiente a CFU-e temprano y tardío, respectivamente; La población 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 low CD150high) contiene todos los progenitores BFU-e; La población P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150 low CD41low) está enriquecida para progenitores basófilos/mastocitos; La población 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) está enriquecida para progenitores megacariocíticos; y la población 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41) contiene progenitores con eritroides, basófilos/mastocitos y potencial megacariocítico (EBMP) y progenitores multipotenciales eritroses/megacariocíticos/basófilos (MPP). Este nuevo enfoque permite una mayor precisión al analizar progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos y también permite hacer referencia a la información del transcriptoma para cada población citométricamente definida por flujo.

Introduction

La eritropoyesis puede dividirse en dos fases principales: eritropoyesis precoz y diferenciación terminal eritroide (Figura 1)1,2,3. En la eritropoyesis temprana, las células madre hematopoyéticas se comprometen con el linaje eritroide y dan lugar a progenitores eritroides tempranos, que se identificaron por primera vez en la década de 1970 en función de su potencial de formación de colonias en medio semisólido 4,5,6,7,8,9 . En términos generales, los progenitores eritroides se dividen en dos categorías: progenitores anteriores que dan lugar a un “estallido” (un gran agregado de grupos de células eritroides más pequeños), llamado “eritroide unitario formador de estallido” o BFU-e 4,5,6; y su progenie, que forman cada uno un único grupo o colonia de células eritroides pequeñas, denominadas “unidad formadora de colonias eritroides” o UFC-e 7,8,9. BFU-e y CFU-e aún no expresan genes eritroides terminales y no son morfológicamente reconocibles. Después de una serie de divisiones celulares de auto-renovación o expansión, la UFC-e experimenta un cambio transcripcional en el que se inducen genes eritroides como globinas, pasando así a la diferenciación terminal eritroide (ETD)1,10. Durante la ETD, los eritroblastos se someten a tres a cinco divisiones celulares madurativas antes de enuclearse para formar reticulocitos, que maduran en glóbulos rojos.

Los eritroblastos durante la diferenciación terminal se clasificaron originalmente en función de su morfología en proeritroblastos, basófilos, policromáticos y ortocromáticos. El advenimiento de la citometría de flujo permitió su clasificación y aislamiento prospectivo basado en el tamaño celular (medido por dispersión directa, FSC) y dos marcadores de superficie celular, CD71 y Ter11911,12,13 (Figura 1). Este y otros enfoques citométricos de flujo similares 14 han revolucionado la investigación de los aspectos moleculares y celulares de la ETD, permitiendo el análisis específico de la etapa de desarrollo de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. El enfoque CD71/Ter119 ahora se usa rutinariamente en el análisis de precursores eritroides.

Hasta hace poco, un enfoque citométrico de flujo similar y accesible para el aislamiento prospectivo directo y de alta pureza de CFU-e y BFU-e de tejido de ratón ha eludido a los investigadores. En cambio, los investigadores han utilizado estrategias citométricas de flujo que aíslan solo una fracción de estos progenitores, a menudo en presencia de células no eritroides que se purifican conjuntamente dentro de los mismos subconjuntos citométricos de flujo21. En consecuencia, la investigación de BFU-e y CFU-e se limitó a sistemas de diferenciación in vitro que derivan y amplifican BFU-e y CFU-e de progenitores de médula ósea anteriores. Entonces es posible aplicar estrategias citométricas de flujo que distinguan la UFC-e de la BFU-e en estos cultivos enriquecidos con progenitores eritroides22,23. Un enfoque alternativo hace uso de UFC-e fetal y BFU-e, que están altamente enriquecidas en la fracción Ter119-negativa del hígado fetal de ratón a mediados de la gestación 10,24,25. Ninguno de estos enfoques, sin embargo, permite la investigación de BFU-e y UFC-e adultos en su estado fisiológico in vivo. La magnitud del desafío puede apreciarse cuando se recuerda que, según los ensayos de formación de colonias, estas células están presentes en la médula ósea adulta con una frecuencia de solo 0,025% y 0,3%, respectivamente6.

El protocolo descrito aquí es un nuevo enfoque citométrico de flujo basado en el análisis transcriptómico de células transcriptómicas de células de médula ósea de ratón Kit+ recién cosechadas (Kit es expresado por todas las poblaciones progenitoras tempranas de la médula ósea)1. Nuestro enfoque contiene algunos marcadores de superficie celular que ya estaban en uso por Pronk et al.21,26. Se utilizaron transcriptomas unicelulares para determinar combinaciones de marcadores de superficie celular que identifican progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos tempranos (Figura 2). Específicamente, la fracción CD55+ de las células Kit+ negativas para linaje (Lin) puede subdividirse en cinco poblaciones, tres de las cuales producen segmentos contiguos de la trayectoria eritroide (Figura 2). Las identidades transcriptómicas de cada una de estas poblaciones se confirmaron mediante clasificación, seguido de scRNAseq y proyección de los transcriptomas unicelulares ordenados en el mapa transcriptómico original (la expresión génica en cada una de las cinco poblaciones y todo el conjunto de datos de médula ósea se puede explorar en https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . El potencial de destino celular de cada una de las poblaciones se confirmó mediante ensayos tradicionales de formación de colonias (Figura 2), así como un nuevo ensayo de destino unicelular de alto rendimiento 1,27. Estos análisis muestran que el nuevo enfoque citométrico de flujo da como resultado un aislamiento de alta pureza de todos los progenitores BFU-e y CFU-e de la médula ósea y el bazo adultos frescos. Específicamente, la población 1 (P1) contiene solo UFC-e y ningún otro progenitor hematopoyético, y la población 2 (P2) contiene todos los progenitores BFU-e de la médula ósea y un pequeño número de UFC-e pero ningún otro progenitor1. El protocolo detallado a continuación se ilustra con un experimento de ejemplo en ratones que fueron inyectados con solución salina o con la hormona estimulante de la eritropoyesis eritropoyetina (Epo).

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos animales A-1586 y 202200017 aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts. NOTA: Aquí se detallan dos protocolos: primero, análisis citométrico de flujo (sección 1), seguido de ajustes de protocolo para la clasificación por citometría de flujo (sección 2). El siguiente protocolo utiliza un citómetro/clasificador de flujo con 10 …

Representative Results

El protocolo describe un enfoque citométrico de flujo para identificar BFU-es y UFC-es en células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Comienza con la recolección de BM fresco y bazo de ratones e inmediatamente la colocación del tejido en hielo. Todos los procedimientos se realizan en el frío para preservar la viabilidad celular. Las células se marcan con un cóctel de anticuerpos de “linaje” que permite la exclusión de todas las células que expresan marcadores de linajes sanguíneos diferenciados (el cóc…

Discussion

La capacidad de aislar prospectivamente progenitores de BFU-e y CFU-e directamente de tejido fresco con alta pureza había eludido previamente a los investigadores. Nuestro nuevo enfoque, validado utilizando scRNAseq y ensayos de destino celular 1,27, ahora ofrece las herramientas para hacer esto.

Hay una serie de puntos clave para ejecutar con éxito tanto la clasificación como los protocolos analíticos. Primero, las células deben …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo es apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK130498, R01DK120639 y R01HL141402

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Life Technologies 15575020
1000 µL large orifice tips USA sceintific 1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody BioLegend 131806
APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody BioLegend 105826
Biotin-CD11b BD Biosciences 557395 M1/70 (clone)
Biotin-CD19 BD Biosciences 553784 1D3 (clone)
Biotin-CD4 BD Biosciences BDB553045 RM4-5 (clone)
Biotin-CD8a BD Biosciences BDB553029 53-6.7 (clone)
Biotin-F4/80 Biolegend 123106 BM8 (clone)
Biotin-Ly-6G and Ly-6C BD Biosciences 553125 RB6-8C5 (clone)
Biotin-TER-119 BD Biosciences 553672 TER-119 (clone)
Bovine Serum Albumin Sigma aldritch A1470
Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody BioLegend 313624
Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody BioLegend 133921
Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody BioLegend 115931
BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells BD Biosciences 563827
ChromPure Rabbit IgG, whole molecule Jackson ImmunoResearch Laboratories 011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Life Technologies D1306
Digital DIVA hardware and software for LSR II BD Biosciences
FITC anti-mouse F4/80 Antibody BioLegend 123108
FITC Rat Anti-CD11b BD Biosciences 557396
FITC Rat Anti-Mouse CD19 BD Biosciences 553785
FITC Rat Anti-Mouse CD4 BD Biosciences 553047
FITC Rat Anti-Mouse CD8a BD Biosciences 553031
FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C BD Biosciences 553127
FlowJo software  FlowJo version 10 Flow cytometer analysis software
LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer BD Biosciences Flow cytometer 
NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set Amazon
Normal rat serum Stem Cell Technologies 13551
PE anti-mouse CD105 Antibody BioLegend 120408
PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody BioLegend 113812
Phosphate Buffered Saline, 10x Solution Fisher scientific BP3994
Streptavidin Nanobeads BioLegend 480016 Magnetic beads

Referências

  1. Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
  2. Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
  3. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
  4. Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
  5. Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
  6. Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
  7. Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
  8. Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
  9. Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
  10. Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
  11. Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
  12. Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
  13. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  14. Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
  15. Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
  16. Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
  17. Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
  18. Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
  19. Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
  20. Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
  21. Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
  22. Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
  23. Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
  24. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  25. Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
  26. Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
  27. Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
  28. Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
  29. Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).

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Citar este artigo
Swaminathan, A., Hwang, Y., Winward, A., Socolovsky, M. Identification and Isolation of Burst-Forming Unit and Colony-Forming Unit Erythroid Progenitors from Mouse Tissue by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (189), e64373, doi:10.3791/64373 (2022).

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