Erytropoiesen kan deles inn i to hovedfaser: tidlig erytropoiese og erytroid terminal differensiering (figur 1)^1,2,3. I tidlig erytropoiese forplikter hematopoietiske stamceller seg til erytroidlinjen og gir opphav til tidlige erytroidprogenitorer, som først ble identifisert på 1970-tallet basert på deres kolonidannende potensial i halvfast medium 4,5,6,7,8,9 . I stor grad er erytroide forfedre delt inn i to kategorier: tidligere forfedre som hver gir opphav til en “burst” (et stort aggregat av mindre erytroidcelleklynger), kalt “burst-forming unit erythroid” eller BFU-e ^4,5,6; og deres avkom, som hver danner en enkelt, liten erytroidcelleklynge eller koloni, kalt “kolonidannende enhet erytroid” eller CFU-e ^7,8,9. BFU-e og CFU-e uttrykker ennå ikke terminale erytroidgener og er ikke morfologisk gjenkjennelige. Etter en rekke selvfornyelses- eller ekspansjonscelledelinger gjennomgår CFU-e en transkripsjonsbryter der erytroidgener som globiner induseres, og går dermed over til erytroid terminal differensiering (ETD)^1,10. Under ETD gjennomgår erytroblaster tre til fem modningscelledelinger før de enukleerer for å danne retikulocytter, som modnes til røde blodlegemer.

Erytroblaster under terminal differensiering ble opprinnelig klassifisert basert på deres morfologi i proerythroblaster, basofile, polykromatiske og ortokromatiske. Ankomsten av flowcytometri tillot deres prospektive sortering og isolasjon basert på cellestørrelse (målt ved fremoverspredning, FSC) og to celleoverflatemarkører, CD71 og Ter119^11,12,13 (figur 1). Denne og lignende flowcytometriske tilnærminger¹⁴ har revolusjonert undersøkelsen av de molekylære og cellulære aspektene ved ETD, noe som tillater utviklingsstadiespesifikk analyse av erytroblaster in vivo og in vitro 10,15,16,17,18,19,20. CD71/Ter119-tilnærmingen brukes nå rutinemessig i analysen av erytroide forløpere.

Inntil nylig har en lignende, tilgjengelig flowcytometrisk tilnærming for direkte, høy renhet prospektiv isolering av CFU-e og BFU-e fra musevev unnsluppet etterforskere. I stedet har forskere brukt flowcytometriske strategier som isolerer bare en brøkdel av disse forfedrene, ofte i nærvær av ikke-erytroidceller som samrenser innenfor de samme flowcytometriske delmengdene²¹. Undersøkelsen av BFU-e og CFU-e var derfor begrenset til in vitro differensieringssystemer som utleder og forsterker BFU-e og CFU-e fra tidligere benmargsprogenitorer. Det er da mulig å anvende flowcytometriske strategier som skiller CFU-e fra BFU-e i disse erytroide forfedreberikede kulturene^22,23. En alternativ tilnærming benytter seg av føtal CFU-e og BFU-e, som er svært beriket i Ter119-negativ fraksjon av musens fosterlever ved midten av svangerskapet 10,24,25. Ingen av disse tilnærmingene tillater imidlertid undersøkelse av voksen BFU-e og CFU-e i deres fysiologiske tilstand in vivo. Størrelsen på utfordringen kan bli verdsatt når man husker at disse cellene, basert på kolonidannelsesanalyser, er tilstede i den voksne benmargen med en frekvens på henholdsvis bare 0,025% og 0,3%, henholdsvis⁶.

Protokollen beskrevet her er en ny flowcytometrisk tilnærming basert på encellet transkriptomisk analyse av nyhøstede Kit ⁺ musebenmargceller (Kit uttrykkes av alle de tidlige stamcellepopulasjonene i benmargen)¹. Vår tilnærming inneholder noen celleoverflatemarkører som allerede var i bruk av Pronk et ^al.21,26. Enkeltcelletranskriptomer ble brukt til å bestemme kombinasjoner av celleoverflatemarkører som identifiserer erytroide og andre tidlige hematopoietiske forfedre (figur 2). Nærmere bestemt kan CD55+-fraksjonen av avstamningsnegative (Lin^–) Kit⁺-celler deles inn i fem populasjoner, hvorav tre gir sammenhengende segmenter av erytroidbanen (figur 2). De transkriptomiske identitetene til hver av disse populasjonene ble bekreftet ved sortering, etterfulgt av scRNAseq og projeksjon av de sorterte enkeltcellede transkriptomene tilbake på det opprinnelige transkriptomiske kartet (genuttrykket i hver av de fem populasjonene og hele benmargsdatasettet kan utforskes i https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Celleskjebnepotensialet til hver av populasjonene ble bekreftet ved hjelp av tradisjonelle kolonidannelsesanalyser (figur 2), samt en ny høykapasitets enkeltcellet skjebneanalyse ^1,27. Disse analysene viser at den nye flowcytometriske tilnærmingen resulterer i isolasjon med høy renhet av alle BFU-e- og CFU-e-forfedrene til ferske voksne benmarg og milt. Nærmere bestemt inneholder populasjon 1 (P1) bare CFU-e og ingen andre hematopoietiske forfedre, og populasjon 2 (P2) inneholder alle benmargens BFU-e forfedre og et lite antall CFU-e, men ingen andre forfedre¹. Den detaljerte protokollen nedenfor er ytterligere illustrert med et eksempeleksperiment hos mus som ble injisert med enten saltvann eller med det erytropoiesestimulerende hormonet erytropoietin (Epo).