フローサイトメトリーによるマウス組織からのバースト形成ユニットおよびコロニー形成ユニット赤血球前駆細胞の同定と単離(英語)
Summary
ここでは、初期バースト形成ユニット赤血球(BFU-e)およびコロニー形成ユニット赤血球(CFU-e)前駆細胞を新鮮なマウス骨髄および脾臓から直接前向きに単離するための新しいフローサイトメトリー法について説明します。単一細胞トランスクリプトームデータに基づいて開発されたこのプロトコルは、組織のすべての赤血球前駆細胞を高純度で分離した最初のプロトコルです。
Abstract
初期の赤血球前駆細胞は、もともとin vitroでのコロニー形成能によって定義され、BFU-eおよびCFU-eとして知られるバースト形成およびコロニー形成の「ユニット」に分類されました。最近まで、新たに単離された成体マウス骨髄から純粋なBFU-eおよびCFU-e前駆細胞を直接前向きかつ完全に単離する方法は利用できませんでした。このギャップに対処するために、マウス骨髄のシングルセルRNA-seq(scRNAseq)データセットを、細胞表面マーカーをコードする遺伝子の発現について分析しました。この解析は細胞運命アッセイと組み合わされ、マウス骨髄または脾臓におけるBFU-eおよびCFU-e前駆細胞の完全かつ純粋なサブセットを同定し、単離することを可能にする新しいフローサイトメトリーアプローチの開発を可能にしました。このアプローチは、好塩基球/肥満細胞および巨核球電位に富むサブセットを含む、他の前駆細胞サブセットも同定する。この方法は、新鮮な骨髄または脾臓細胞をKitおよびCD55に向けられた抗体で標識することからなる。これらのマーカーの両方を発現する前駆細胞は、次に5つの主要な集団に細分される。集団1(P1またはCFU-e、キット+ CD55 + CD49f med/low CD105 med/high CD71 med/high)には、すべてのCFU-e前駆細胞が含まれており、さらにP1-low(CD71 med CD150高)とP1-hi(CD71高CD150低)に細分され、それぞれCFU-eの初期と後期に対応します。集団2(P2またはBFU-e、キット+ CD55 + CD49f 中/低CD105中/高CD71低CD150高)には、すべてのBFU-e前駆細胞が含まれています。集団P3(P3、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150低CD41低)は、好塩基球/肥満細胞前駆細胞が豊富です。集団4(P4、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150高CD41 +)は巨核球前駆細胞が豊富です。集団5(P5、キット+ CD55 + CD49f中/高CD105中/低CD150高CD41–)には、赤血球、好塩基球/肥満細胞、および巨核球能(EBMP)および赤血球/巨核球/好塩基球バイアス多電位前駆細胞(MPP)を持つ前駆細胞が含まれています。この新しいアプローチにより、赤血球やその他の造血前駆細胞を分析する際の精度が向上し、フローサイトメトリーで定義された各集団のトランスクリプトーム情報を参照することもできます。
Introduction
赤血球形成は、早期赤血球形成と赤血球終末分化の2つの主要な段階に分けることができます(図1)1,2,3。初期の赤血球形成では、造血幹細胞は赤血球系にコミットし、半固体培地でのコロニー形成の可能性に基づいて1970年代に最初に同定された初期の赤血球前駆細胞を生じさせます4,5,6,7,8,9 .大まかに言えば、赤血球前駆細胞は2つのカテゴリーに分けられます:それぞれが「バースト形成ユニットエリスロイド」またはBFU-e 4,5,6と呼ばれる「バースト」(より小さな赤血球細胞クラスターの大きな集合体)を引き起こす初期の前駆細胞。そしてそれらの子孫は、それぞれが単一の小さな赤血球細胞クラスターまたはコロニーを形成し、「コロニー形成ユニット赤血球」またはCFU-e 7,8,9と名付けられる。BFU-eおよびCFU-eはまだ末端赤血球遺伝子を発現しておらず、形態学的に認識できません。CFU-eは、自己複製または増殖細胞分裂を数回行った後、グロビンなどの赤血球遺伝子が誘導される転写スイッチを受け、赤血球末端分化(ETD)に移行します1,10。ETDの間、赤芽球は網状赤血球を形成するために核形成する前に3〜5回の成熟細胞分裂を受け、赤血球に成熟します。
末端分化中の赤芽球は、もともとその形態に基づいて、前赤芽球、好塩基球、多色、およびオルソクロマティックに分類されていました。フローサイトメトリーの出現により、細胞サイズ(前方散乱、FSCで測定)と2つの細胞表面マーカーCD71およびTer11911、12、13に基づく将来の選別と分離が可能になりました(図1)。これおよび同様のフローサイトメトリーアプローチ14は、ETDの分子的および細胞的側面の研究に革命をもたらし、in vivoおよびin vitroでの赤芽球の発生段階特異的分析を可能にしました10、15、16、17、18、19、20。CD71/Ter119アプローチは現在、赤血球前駆体の分析に日常的に使用されています。
最近まで、マウス組織からCFU-eおよびBFU-eを直接高純度で前向きに単離するための同様のアクセス可能なフローサイトメトリーアプローチは、研究者には知られていませんでした。代わりに、研究者らは、多くの場合、同じフローサイトメトリーサブセット内で共精製する非赤血球細胞の存在下で、これらの前駆細胞のほんの一部のみを単離するフローサイトメトリー戦略を使用してきました21。その結果、BFU-eおよびCFU-eの調査は、初期の骨髄前駆細胞からBFU-eおよびCFU-eを誘導および増幅するin vitro分化系に限定されていました。次いで、CFU-eをBFU-eから区別するフローサイトメトリー戦略をこれらの赤血球前駆細胞富化培養物に適用することができる22,23。別のアプローチでは、妊娠中期にマウス胎児肝臓のTer119陰性画分が非常に濃縮されている胎児CFU-eおよびBFU-eを利用します10,24,25。しかしながら、これらのアプローチのいずれも、in vivoでの生理学的状態における成人のBFU-eおよびCFU-eの調査を可能にしない。コロニー形成アッセイに基づいて、これらの細胞がそれぞれわずか0.025%および0.3%の頻度で成体骨髄に存在することを思い出すと、課題の大きさが理解されるかもしれません6。
ここで説明するプロトコルは、採取したばかりのKit+マウス骨髄細胞のシングルセルトランスクリプトミクス解析に基づく新しいフローサイトメトリーアプローチです(Kitは骨髄の初期前駆細胞集団のすべてによって発現されます)1。私たちのアプローチには、Pronkらによってすでに使用されていたいくつかの細胞表面マーカーが含まれています21,26。シングルセルトランスクリプトームを使用して、赤血球および他の初期造血前駆細胞を同定する細胞表面マーカーの組み合わせを決定しました(図2)。具体的には、系統陰性(Lin–)Kit+細胞のCD55+画分を5つの集団に細分することができ、そのうち3つは赤血球軌道の連続したセグメントを生成します(図2)。これらの各集団のトランスクリプトーム同一性は、ソート、続いてscRNAseq、およびソートされた単一細胞トランスクリプトームの元のトランスクリプトームマップへの投影によって確認されました(5つの集団のそれぞれおよび骨髄データセット全体の遺伝子発現は https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html で探索できます)1.各集団の細胞運命の可能性は、従来のコロニー形成アッセイ(図2)および新規のハイスループット単一細胞運命アッセイ1,27を用いて確認された。これらの解析は、新しいフローサイトメトリーアプローチにより、新鮮な成人骨髄および脾臓のすべてのBFU-eおよびCFU-e前駆細胞の高純度分離が得られることを示しています。具体的には、集団1(P1)にはCFU-eのみが含まれ、他の造血前駆細胞は含まれず、集団2(P2)には骨髄のBFU-e前駆細胞と少数のCFU-eがすべて含まれ、他の前駆細胞は含まれていません1。以下の詳細なプロトコルは、生理食塩水または赤血球生成刺激ホルモンエリスロポエチン(Epo)のいずれかを注射したマウスにおける実験例でさらに説明される。
Protocol
Representative Results
Discussion
BFU-eおよびCFU-eの前駆細胞を高純度で新鮮な組織から直接前向きに単離する能力は、以前は研究者にとって避けられていませんでした。scRNAseqおよび細胞運命アッセイ1,27を使用して検証された私たちの新しいアプローチは、これを行うためのツールを提供します。
ソートプロトコルと分析プロトコルの両方を正常に実行するた?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、NIH助成金R01DK130498、R01DK120639、およびR01HL141402によってサポートされています。
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Life Technologies | 15575020 | |
| 1000 µL large orifice tips | USA sceintific | 1011-9000 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse CD55 (DAF) Antibody | BioLegend | 131806 | |
| APC/Cyanine7 anti-mouse CD117 (c-kit) Antibody | BioLegend | 105826 | |
| Biotin-CD11b | BD Biosciences | 557395 | M1/70 (clone) |
| Biotin-CD19 | BD Biosciences | 553784 | 1D3 (clone) |
| Biotin-CD4 | BD Biosciences | BDB553045 | RM4-5 (clone) |
| Biotin-CD8a | BD Biosciences | BDB553029 | 53-6.7 (clone) |
| Biotin-F4/80 | Biolegend | 123106 | BM8 (clone) |
| Biotin-Ly-6G and Ly-6C | BD Biosciences | 553125 | RB6-8C5 (clone) |
| Biotin-TER-119 | BD Biosciences | 553672 | TER-119 (clone) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma aldritch | A1470 | |
| Brilliant Violet 421 anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313624 | |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD41 Antibody | BioLegend | 133921 | |
| Brilliant Violet 650 anti-mouse CD150 (SLAM) Antibody | BioLegend | 115931 | |
| BUV395 Rat Anti-Mouse TER-119/Erythroid Cells | BD Biosciences | 563827 | |
| ChromPure Rabbit IgG, whole molecule | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 011-000-003 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Life Technologies | D1306 | |
| Digital DIVA hardware and software for LSR II | BD Biosciences | ||
| FITC anti-mouse F4/80 Antibody | BioLegend | 123108 | |
| FITC Rat Anti-CD11b | BD Biosciences | 557396 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD19 | BD Biosciences | 553785 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 553047 | |
| FITC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553031 | |
| FITC Rat Anti-Mouse Ly-6G and LY-6C | BD Biosciences | 553127 | |
| FlowJo software | FlowJo | version 10 | Flow cytometer analysis software |
| LSR II digital multiparameter flow cytometer analyzer | BD Biosciences | Flow cytometer | |
| NewlineNY Stainless Steel Hand Masher & Bowl, Mortar and Pestle Set | Amazon | ||
| Normal rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| PE anti-mouse CD105 Antibody | BioLegend | 120408 | |
| PE/Cyanine7 anti-mouse CD71 Antibody | BioLegend | 113812 | |
| Phosphate Buffered Saline, 10x Solution | Fisher scientific | BP3994 | |
| Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480016 | Magnetic beads |
Referências
- Tusi, B. K., et al. Population snapshots predict early haematopoietic and erythroid hierarchies. Nature. 555 (7694), 54-60 (2018).
- Socolovsky, M. The role of specialized cell cycles during erythroid lineage development: Insights from single-cell RNA sequencing. International Journal of Hematology. 116 (2), 163-173 (2022).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2021).
- Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M., Heath, D. S., Robinson, W. A. Properties of Cells that Produce Erythrocytic Colonies In Vitro. Hemopoiesis in Culture. , (1974).
- Heath, D. S., Axelrad, A. A., McLeod, D. L., Shreeve, M. M. Separation of the erythropoietin-responsive progenitors BFU-E and CFU-E in mouse bone marrow by unit gravity sedimentation. Blood. 47 (5), 777-792 (1976).
- Iscove, N. N., Sieber, F. Erythroid progenitors in mouse bone marrow detected by macroscopic colony formation in culture. Experimental Hematology. 3 (1), 32-43 (1975).
- Gregory, C. J., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: State of differentiation. Journal of Cell Physiology. 81 (3), 411-420 (1973).
- Gregory, C. J., Tepperman, A. D., McCulloch, E. A., Till, J. E. Erythropoietic progenitors capable of colony formation in culture: Response of normal and genetically anemic W-W-V mice to manipulations of the erythron. Journal of Cell Physiology. 84 (1), 1-12 (1974).
- Gregory, C. J. Erythropoietin sensitivity as a differentiation marker in the hemopoietic system: studies of three erythropoietic colony responses in culture. Journal of Cell Physiology. 89 (2), 289-301 (1976).
- Pop, R., et al. A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression. PLoS Biology. 8 (9), 1000484 (2010).
- Koulnis, M., et al. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. Journal of Visualized Experiments. (54), e2809 (2011).
- Liu, Y., et al. Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in vivo. Blood. 108 (1), 123-133 (2006).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Chen, K., et al. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (41), 17413-17418 (2009).
- Hwang, Y., Hidalgo, D., Socolovsky, M. The shifting shape and functional specializations of the cell cycle during lineage development. WIREs Mechanisms of Disease. 13 (2), 1504 (2020).
- Hidalgo, D., et al. EpoR stimulates rapid cycling and larger red cells during mouse and human erythropoiesis. Nature Communications. 12 (1), 7334 (2021).
- Porpiglia, E., Hidalgo, D., Koulnis, M., Tzafriri, A. R., Socolovsky, M. Stat5 signaling specifies basal versus stress erythropoietic responses through distinct binary and graded dynamic modalities. PLoS Biology. 10 (8), 1001383 (2012).
- Koulnis, M., et al. Contrasting dynamic responses in vivo of the Bcl-xL and Bim erythropoietic survival pathways. Blood. 119 (5), 1228-1239 (2012).
- Shearstone, J. R., et al. Global DNA demethylation during mouse erythropoiesis in vivo. Science. 334 (6057), 799-802 (2011).
- Koulnis, M., Liu, Y., Hallstrom, K., Socolovsky, M. Negative autoregulation by Fas stabilizes adult erythropoiesis and accelerates its stress response. PLoS One. 6 (7), 21192 (2011).
- Pronk, C. J., et al. Elucidation of the phenotypic, functional, and molecular topography of a myeloerythroid progenitor cell hierarchy. Cell Stem Cell. 1 (4), 428-442 (2007).
- Dolznig, H., et al. Expansion and differentiation of immature mouse and human hematopoietic progenitors. Methods in Molecular Medicine. 105, 323-344 (2005).
- Li, J., et al. Isolation and transcriptome analyses of human erythroid progenitors: BFU-E and CFU-E. Blood. 124 (24), 3636-3645 (2014).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: Functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Flygare, J., Rayon Estrada, V., Shin, C., Gupta, S., Lodish, H. F. HIF1alpha synergizes with glucocorticoids to promote BFU-E progenitor self-renewal. Blood. 117 (12), 3435-3444 (2011).
- Pronk, C. J., Attema, J., Rossi, D. J., Sigvardsson, M., Bryder, D. Deciphering developmental stages of adult myelopoiesis. Cell Cycle. 7 (6), 706-713 (2008).
- Khoramian Tusi, B., Socolovsky, M. High-throughput single-cell fate potential assay of murine hematopoietic progenitors in vitro. Experimental Hematology. 60, 21-29 (2018).
- Erslev, A. J., Caro, J. Erythropoietin titers in response to anemia or hypoxia. Blood Cells. 13 (1-2), 207-216 (1987).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. The molecular mechanism of erythropoietin action. European Journal of Biochemistry. 210 (3), 649-663 (1992).
