L’eritropoiesi può essere suddivisa in due fasi principali: eritropoiesi precoce e differenziazione eritroide terminale (Figura 1)^1,2,3. Nell’eritropoiesi precoce, le cellule staminali ematopoietiche si impegnano nella linea eritroide e danno origine ai primi progenitori eritroidi, che sono stati identificati per la prima volta nel 1970 sulla base del loro potenziale di formazione di colonie in mezzo semi-solido 4,5,6,7,8,9 . In generale, i progenitori eritroidi sono divisi in due categorie: progenitori precedenti che danno origine ciascuno a un “burst” (un grande aggregato di cluster di cellule eritroidi più piccoli), chiamato “burst-forming unit erythroid” o BFU-e ^4,5,6; e la loro progenie, che formano ciascuna un singolo, piccolo gruppo o colonia di cellule eritroidi, chiamato “unità eritroide formante colonie” o CFU-e ^7,8,9. BFU-e e CFU-e non esprimono ancora geni eritroidi terminali e non sono morfologicamente riconoscibili. Dopo una serie di divisioni cellulari di auto-rinnovamento o espansione, la CFU-e subisce un passaggio trascrizionale in cui vengono indotti geni eritroidi come le globine, passando così alla differenziazione eritroide terminale (ETD)^1,10. Durante l’ETD, gli eritroblasti subiscono da tre a cinque divisioni cellulari di maturazione prima dell’enucleazione per formare reticolociti, che maturano in globuli rossi.

Gli eritroblasti durante la differenziazione terminale sono stati originariamente classificati in base alla loro morfologia in proeritroblasti, basofili, policromatici e ortocromatici. L’avvento della citometria a flusso ha permesso il loro ordinamento prospettico e isolamento in base alle dimensioni delle cellule (misurate mediante forward scatter, FSC) e a due marcatori di superficie cellulare, CD71 e Ter119^11,12,13 (Figura 1). Questo e simili approcci citometrici a flusso 14 hanno rivoluzionato lo studio degli aspetti molecolari e cellulari dell’ETD, consentendo l’analisi specifica dello stadio di sviluppo degli eritroblasti in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approccio CD71/Ter119 è ora utilizzato di routine nell’analisi dei precursori eritroidi.

Fino a poco tempo fa, un approccio citometrico a flusso simile e accessibile per l’isolamento prospettico diretto e ad alta purezza di CFU-e e BFU-e dal tessuto di topo è sfuggito ai ricercatori. Invece, i ricercatori hanno utilizzato strategie citometriche a flusso che isolano solo una frazione di questi progenitori, spesso in presenza di cellule non eritroidi che co-purificano all’interno degli stessi sottoinsiemi citometrici a flusso²¹. Di conseguenza, lo studio di BFU-e e CFU-e è stato limitato a sistemi di differenziazione in vitro che derivano e amplificano BFU-e e CFU-e da precedenti progenitori del midollo osseo. E’ quindi possibile applicare strategie citometriche a flusso che distinguono CFU-e da BFU-e in queste colture eritroidi arricchite con progenitori^22,23. Un approccio alternativo fa uso di CFU-e fetale e BFU-e, che sono altamente arricchiti nella frazione Ter119-negativa del fegato fetale di topo a metà gestazione 10,24,25. Nessuno di questi approcci, tuttavia, consente lo studio di BFU-e e CFU-e adulti nel loro stato fisiologico in vivo. L’entità della sfida può essere apprezzata quando si ricorda che, sulla base di saggi di formazione di colonie, queste cellule sono presenti nel midollo osseo adulto ad una frequenza di solo 0,025% e 0,3%, rispettivamente⁶.

Il protocollo qui descritto è un nuovo approccio citometrico a flusso basato sull’analisi trascrittomica a singola cellula di cellule midollari di topo Kit⁺ appena raccolte (Kit è espresso da tutte le prime popolazioni progenitrici del midollo osseo)¹. Il nostro approccio contiene alcuni marcatori di superficie cellulare che erano già in uso da Pronk et ^al.21,26. I trascrittomi a singola cellula sono stati utilizzati per determinare combinazioni di marcatori di superficie cellulare che identificano eritroidi e altri progenitori ematopoietici precoci (Figura 2). In particolare, la frazione CD55⁺ delle cellule Kit⁺ lin-negative può essere suddivisa in cinque popolazioni, tre delle quali producono segmenti contigui della traiettoria eritroide (Figura 2). Le identità trascrittomiche di ciascuna di queste popolazioni sono state confermate mediante ordinamento, seguito da scRNAseq e proiezione dei trascrittomi monocellulari ordinati sulla mappa trascrittomica originale (l’espressione genica in ciascuna delle cinque popolazioni e l’intero set di dati del midollo osseo possono essere esplorati in https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Il potenziale di destino cellulare di ciascuna delle popolazioni è stato confermato utilizzando saggi tradizionali di formazione di colonie (Figura 2), nonché un nuovo saggio di destino a singola cellula ad alto rendimento ^1,27. Queste analisi mostrano che il nuovo approccio citometrico a flusso si traduce in un isolamento ad alta purezza di tutti i progenitori BFU-e e CFU-e del midollo osseo e della milza adulti freschi. In particolare, la popolazione 1 (P1) contiene solo CFU-e e nessun altro progenitore ematopoietico, e la popolazione 2 (P2) contiene tutti i progenitori BFU-e del midollo osseo e un piccolo numero di CFU-e ma nessun altro progenitore¹. Il protocollo dettagliato di seguito è ulteriormente illustrato con un esperimento di esempio in topi a cui è stata iniettata soluzione salina o con l’ormone stimolante l’eritropoiesi (Epo).