L’érythropoïèse peut être divisée en deux phases principales : l’érythropoïèse précoce et la différenciation érythroïde terminale (Figure 1)^1,2,3. Dans l’érythropoïèse précoce, les cellules souches hématopoïétiques s’engagent dans la lignée érythroïde et donnent naissance à des progéniteurs érythroïdes précoces, qui ont été identifiés pour la première fois dans les années 1970 en fonction de leur potentiel de formation de colonies en milieu semi-solide 4,5,6,7,8,9 . En gros, les progéniteurs érythroïdes sont divisés en deux catégories: les progéniteurs antérieurs qui donnent chacun lieu à un « éclatement » (un grand agrégat de petits amas de cellules érythroïdes), appelé « unité érythroïde formant un éclatement » ou BFU-e ^4,5,6; et leur descendance, qui forment chacune un seul petit amas de cellules érythroïdes ou une seule colonie, appelée « unité érythroïde formant colonie » ou UFC-e ^7,8,9. BFU-e et CFU-e n’expriment pas encore de gènes érythroïdes terminaux et ne sont pas morphologiquement reconnaissables. Après un certain nombre de divisions cellulaires d’auto-renouvellement ou d’expansion, l’UFC-e subit un commutateur transcriptionnel dans lequel des gènes érythroïdes tels que les globines sont induits, passant ainsi à la différenciation terminale érythroïde (ETD)^1,10. Au cours de l’ETD, les érythroblastes subissent trois à cinq divisions cellulaires de maturation avant d’énucléer pour former des réticulocytes qui mûrissent en globules rouges.

Les érythroblastes au cours de la différenciation terminale ont été classés à l’origine en fonction de leur morphologie en proérythroblastes, basophiles, polychromatiques et orthochromatiques. L’avènement de la cytométrie en flux a permis leur tri prospectif et leur isolement en fonction de la taille des cellules (mesurée par diffusion directe, FSC) et de deux marqueurs de surface cellulaire, CD71 et Ter119^11,12,13 (Figure 1). Cette approche et des approches similaires de cytométrie en flux 14 ont révolutionné l’étude des aspects moléculaires et cellulaires de l’ETD, permettant une analyse spécifique au stade de développement des érythroblastes in vivo et in vitro 10,15,16,17,18,19,20. L’approche CD71/Ter119 est maintenant couramment utilisée dans l’analyse des précurseurs érythroïdes.

Jusqu’à récemment, une approche cytométrique en flux similaire et accessible pour l’isolement prospectif direct et de haute pureté de CFU-e et BFU-e à partir de tissus de souris a échappé aux chercheurs. Au lieu de cela, les chercheurs ont utilisé des stratégies de cytométrie en flux qui n’isolent qu’une fraction de ces progéniteurs, souvent en présence de cellules non érythroïdes qui co-purifient dans les mêmes sous-ensembles cytométriques^{en flux 21}. Par conséquent, l’étude de BFU-e et CFU-e s’est limitée aux systèmes de différenciation in vitro qui dérivent et amplifient BFU-e et CFU-e à partir de progéniteurs antérieurs de la moelle osseuse. Il est alors possible d’appliquer des stratégies de cytométrie en flux qui distinguent CFU-e de BFU-e dans ces cultures enrichies en progéniteurs érythroïdes^22,23. Une autre approche utilise l’UFC-e et l’UFB-e fœtales, qui sont hautement enrichies en la fraction Ter119-négative du foie fœtal de souris au milieu de la gestation 10,24,25. Cependant, aucune de ces approches ne permet d’étudier l’état physiologique in vivo de l’UFC-e et de l’UFC-e chez l’adulte. L’ampleur du défi peut être appréciée si l’on se souvient que, sur la base des essais de formation de colonies, ces cellules sont présentes dans la moelle osseuse adulte à une fréquence de seulement 0,025% et 0,3%, respectivement⁶.

Le protocole décrit ici est une nouvelle approche de cytométrie en flux basée sur l’analyse transcriptomique unicellulaire de cellules de moelle osseuse de souris Kit⁺ fraîchement récoltées (Kit est exprimé par toutes les premières populations progénitrices de la moelle osseuse)¹. Notre approche contient certains marqueurs de surface cellulaire qui étaient déjà utilisés par Pronk et ^al.21,26. Des transcriptomes unicellulaires ont été utilisés pour déterminer des combinaisons de marqueurs de surface cellulaire qui identifient les progéniteurs érythroïdes et autres progéniteurs hématopoïétiques précoces (Figure 2). Plus précisément, la fraction CD55+ des cellules Kit⁺ de lignée négative peut être subdivisée en cinq populations, dont trois produisent des segments contigus de la trajectoire érythroïde (figure 2). Les identités transcriptomiques de chacune de ces populations ont été confirmées par tri, suivi d’un scRNAseq et d’une projection des transcriptomes unicellulaires triés sur la carte transcriptomique originale (l’expression génique dans chacune des cinq populations et l’ensemble des données sur la moelle osseuse peuvent être explorés dans https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)¹ . Le potentiel de devenir cellulaire de chacune des populations a été confirmé à l’aide d’essais traditionnels de formation de colonies (figure 2), ainsi que d’un nouveau test de devenir unicellulaire à haut débit ^1,27. Ces analyses montrent que la nouvelle approche de cytométrie en flux permet d’isoler de haute pureté tous les progéniteurs BFU-e et CFU-e de la moelle osseuse et de la rate adultes fraîches. Plus précisément, la population 1 (P1) ne contient que l’UFC-e et aucun autre progéniteur hématopoïétique, et la population 2 (P2) contient tous les progéniteurs BFU-e de la moelle osseuse et un petit nombre d’UFC-e mais aucun autre progéniteur¹. Le protocole détaillé ci-dessous est illustré par un exemple d’expérience chez des souris qui ont reçu une injection de solution saline ou de l’hormone stimulant l’érythropoïèse érythropoïétine (Epo).