红细胞生成可分为两个主要阶段：早期红细胞生成和红系末端分化（图1）¹，^2，3。在早期红细胞生成中，造血干细胞致力于红系并产生早期红系祖细胞，这些祖细胞在 1970 年代首次根据其在半固体培养基中的集落形成潜力被鉴定⁴，⁵，⁶，⁷，^8，9.从广义上讲，红系祖细胞分为两类：早期祖细胞，每个祖细胞产生“爆发”（较小红细胞簇的大集合），称为“爆发形成单位红细胞”或BFU-e⁴，^5，6;和它们的后代，每个形成一个单一的小红细胞簇或集落，称为“集落形成单位红细胞”或CFU-e⁷，^8，9。BFU-e和CFU-e尚未表达终末红系基因，并且在形态上不可识别。经过多次自我更新或扩增细胞分裂后，CFU-e经历转录开关，其中诱导珠蛋白等红系基因，从而转变为红系末端分化（ETD）^1，10。在ETD期间，成红细胞在剜除形成网织红细胞之前经历三到五次成熟细胞分裂，网织红细胞成熟为红细胞。

终末分化期间的成红细胞最初根据其形态分为原成红细胞、嗜碱性、多色和正色。流式细胞术的出现允许基于细胞大小（通过前向散射，FSC测量）和两个细胞表面标记CD71和Ter119 11，^12，13进行前瞻性分选和分离（图1）。这种和类似的流式细胞术方法¹⁴彻底改变了ETD分子和细胞方面的研究，允许在体内和体外对成红细胞进行发育阶段特异性分析10，¹⁵，¹⁶，^17，18，^19，20。CD71/Ter119方法现在常规用于红系前体的分析。

直到最近，研究人员还缺乏一种类似的、可访问的流式细胞术方法，用于从小鼠组织中直接、高纯度地前瞻性分离CFU-e和BFU-e。相反，研究人员使用了流式细胞术策略，仅分离出这些祖细胞的一小部分，通常是在存在在同一流式细胞术亚群中共同纯化的非红系细胞的情况下²¹。因此，BFU-e和CFU-e的研究仅限于体外分化系统，这些系统从早期骨髓祖细胞衍生和扩增BFU-e和CFU-e。然后可以在这些富含红系祖细胞的培养物中应用流式细胞术策略来区分CFU-e和BFU-e22^，23。另一种方法是利用胎儿CFU-e和BFU-e，它们在妊娠中期小鼠胎儿肝脏的Ter119阴性部分中高度富集¹⁰，^24，25。然而，这两种方法都不允许研究体内生理状态下的成年BFU-e和CFU-e。当回想一下，基于集落形成测定，这些细胞分别以0.025%和0.3%的频率存在于成人骨髓中时，可以理解挑战的严重^性6。

这里描述的方案是一种新颖的流式细胞术方法，基于新鲜收获的Kit⁺小鼠骨髓细胞的单细胞转录组学分析（Kit由骨髓的所有早期祖细胞群表达）¹。我们的方法包含一些已被Pronk等人使用的细胞表面标记物^21，26。单细胞转录组用于确定识别红系和其他早期造血祖细胞的细胞表面标志物的组合（图2）。具体而言，谱系阴性（Lin^–）Kit+细胞的CD55⁺部分可以细分为五个群体，其中三个产生红系轨迹的连续片段（图2）。通过分选确认这些群体中每个群体的转录组身份，然后进行scRNAseq并将分选的单细胞转录组投影回原始转录组图谱（五个群体中每个群体和整个骨髓数据集的基因表达可以在 https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html 中探索）¹.使用传统的集落形成测定（图2）以及新颖的高通量单细胞命运测定1^，27确认了每个群体的细胞命运潜力。这些分析表明，新型流式细胞术方法可高纯度分离新鲜成人骨髓和脾脏的所有BFU-e和CFU-e祖细胞。具体而言，群体 1 （P1） 仅包含 CFU-e 而不包含其他造血祖细胞，群体 2 （P2） 包含骨髓的所有 BFU-e 祖细胞和少量 CFU-e，但没有其他祖细胞¹。下面的详细方案通过注射盐水或促红细胞生成激素促红细胞生成素（Epo）的小鼠的示例实验进一步说明。