Summary
여기에 제시된 것은 리슈만편모충 주요 프로마스티고테를 사용하여 기공 형성 독소에 의해 유도된 결합, 세포독성 및 신호전달을 결정하는 프로토콜입니다. 스트렙톨리신 O를 사용한 개념 증명이 제공됩니다. 다른 독소는 또한 독소 내성의 새로운 메커니즘을 정의하기 위해 L. major에서 사용할 수 있는 유전적 돌연변이를 활용하는 데 사용될 수 있습니다.
Abstract
세포가 PFT로 인한 막 손상에 저항하기 때문에 기공 형성 독소(PFT)의 기능과 메커니즘을 이해하는 것은 어렵습니다. 생물 물리학 적 접근법은 기공 형성을 이해하는 데 도움이되지만, 종종 막 지질과 단백질의 완전한 보완이 부족한 환원 주의적 접근법에 의존합니다. 배양 된 인간 세포는 대체 시스템을 제공하지만 복구 메커니즘의 복잡성과 중복으로 인해 특정 메커니즘을 식별하기가 어렵습니다. 대조적으로, 피부 리슈만편모충증을 담당하는 인간 원생동물 병원체인 리슈만편모충은 복잡성과 생리학적 관련성 사이의 최적의 균형을 제공합니다. L. major 는 유전적으로 다루기 쉽고 시험관 내에서 고밀도로 배양될 수 있으며 섭동이 감염에 미치는 영향은 확립된 쥐 모델에서 측정할 수 있습니다. 또한 L. major 는 포유류와 구별되는 지질을 합성하여 막 역학을 변경할 수 있습니다. 막 역학의 이러한 변화는 가장 잘 특성화된 독소 계열인 콜레스테롤 의존성 세포용해제(CDC)의 PFT로 프로젝션할 수 있습니다. CDC는 리슈만편모충 막의 에르고스테롤에 결합하여 L. major 프로마스티고테를 죽일 수 있으며, 이는 L. major 가 PFT 기능의 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 데 적합한 모델 시스템임을 나타냅니다 . 이 연구는 기생충 배양, 지질 감수성 평가를위한 유전 도구, 막 결합 분석 및 세포 사멸 분석을 포함하여 L. 주요 프로마스티고트에서 PFT 기능을 테스트하는 방법을 설명합니다. 이러한 분석은 진화적으로 다양한 유기체와 지질 조직의 공통점에 걸쳐 PFT 기능을 이해하기 위한 강력한 모델 시스템으로 L. major 를 신속하게 사용할 수 있도록 합니다.
Introduction
기공 형성 독소(PFT)는 박테리아 독소의 가장 큰 계열이지만1, 세포를 천공하고 파괴하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 가장 잘 연구된 모공 형성 독소 계열은 콜레스테롤 의존성 세포질(CDC)입니다. CDC는 주로 괴사 성 근막염의 원인균 인 Streptococcus pyogenes2를 포함한 그람 양성 박테리아에 의해 합성됩니다. S. pyogenes 는 숙주 세포의 원형질막에 있는 스테롤에 단량체로 결합하여 올리고머화하고 ~20-30nm 기공을 막1에 삽입하는 CDC 스트렙톨리신 O(SLO)를 분비합니다. 이 과정에서 지질이하는 역할은 아직 결정되지 않았습니다.
지질-CDC 상호작용을 연구하는 한 가지 접근법은 화학적으로 정의된 리포좀을 사용하는 것입니다. 정의된 리포좀은 독소 결합 및 기공 형성3,4을 유지하는 데 필요한 지질의 역치에 대한 정보를 제공하지만 세포 기능을 완전히 요약하지는 않습니다. 예를 들어, 재구성된 리포좀은 포유류 숙주의 지질 비대칭성과 독소에 대한 반응의 지질 변형이 부족합니다5. 리포좀에 대한 한 가지 대안은 포유류 세포주를 사용하는 것입니다. 이러한 세포주는 생리학적으로 더 관련이 있지만 독소 감지 및내성 메커니즘에는 상당한 수준의 중복성이 있습니다2. 결과적으로 CDC에 저항하는 데 사용되는 복구 경로는 제대로 결정되지 않은 상태로 남아 있습니다. 특히,Ca 2+ 유입은 막 복구1의 주요 활성화 제입니다. Ca 2+ 유입의 하류에는 세라마이드 의존적 복구 6,7 및 MEK 의존적 복구 경로6를 포함한 여러 경로가 참여합니다. 이러한 경로는 수송에 필요한 엔도솜 분류 복합체(ESCRT)8 및 부속신 6,9,10을 포함한 다른 단백질 이펙터와 상호 작용합니다. 포유류 세포에서 이러한 경로를 해부하는 것은 데이터 해석을 혼란스럽게 하는 중복성으로 인해 어렵습니다.
복구 경로를 해부하기 위해 복잡성과 단순성의 균형을 맞추는 한 가지 방법은 Leishmania 속의 원생 동물 병원체와 같은 더 간단한 유기체를 사용하는 것입니다. 리슈만편모충 sp. 인간과 다른 동물에서 리슈만편모충증을 유발합니다. 리슈만편모충증은 종 및 기타 요인에 따라 피부 리슈만편모충증(자가 제한된 피부 병변)에서 치명적인 내장 리슈만편모충증(간비장비대)에 이르기까지 다양합니다11. 피부 리슈만편모충증의 원인균인 리슈만편모충은 모래편모충 벡터를 통해 인간에게 전염되며 리슈만편모충 기능과 감염을 이해하는 데 사용됩니다12. 또한, 리슈만편모충 sp. 아르 디제닉12. 그들은 amastigotes라고 불리는 세포 내 포유류 대 식세포 기생충과 모래 파리12에서 자유롭게 수영하는 편모 모양의 프로 마스 티고트로 존재합니다. L. 주요 프로마스티고테는 M199와 같은 혈청 보충 배지에서 고밀도13으로 배양할 수 있습니다. 프로마스티고테는 또한 유전적으로 다루기 쉽습니다. 지질 생합성 경로를 표적으로 하는 것을 포함하여 많은 유전자 녹아웃이 존재합니다13. 이러한 녹아웃은 Balb/c 마우스13의 감염을 통해 감염성 및 병변 발달의 성장 및 차이에 대해 평가할 수 있습니다.
리슈만편모충 배양의 상대적 용이성과 지질 생합성 녹아웃의 범위 외에도 기생충은 포유류보다 더 단순한 게놈을 가지고 있습니다. 리슈만편모충의 가장 잘 특성화된 종은 L. major로, 지질 대사에 결함이 있는 돌연변이와 같은 기존의 많은 유전 도구를 가지고 있습니다14. 특히, 많은 복구 단백질이 없습니다. L. major는 아넥신과 같은 주요 포유류 복구 단백질에 대해 현재까지 확인된 동족체가 없습니다. 이것은 포유류 시스템의 복잡성없이 진화 적으로 보존 된 복구 경로의 특성화를 가능하게합니다. 그러나 수리 경로는 현재까지 리슈만편모충에서 특성화되지 않았습니다. 동시에 MEK 경로6과 같은 복구와 관련된 주요 신호 전달 경로는 리슈만편모충 sp.15,16에서 보존되지만 동족체를 검증해야 합니다. 미토 겐 활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 경로는 L. mexicana에서 잘 연구되어 포유류 세포의 세포 내 생존 및 열 안정성에 기여하고 메타 사이클 생성을 제어합니다16. 리슈만편모충 sp.에서는 15개의 MAPK 중 10개가17개로 특성화되었습니다. LmMAPK9 및 LmMAPK13은 보존된 인산화 립 서열에서의 동일성에 기초하여 포유동물 ERK1/2와 가장 유사한 것으로 예측된다. 인산화 립 서열은 포유동물 ERK1/2 및 LmMAPK9 및 LmMAPK13 둘 다에 대해 TEY이다. 그러나, 리슈만편모충 MAPK 중 8개는 TDY 인산화 모티프15를 갖는다. 적어도 두 개의 MEK 동족체가 리슈만편모충 sp., LmxMKK18 및 MEKK-관련 키나아제(MRK1)19에서 확인되었다. 이것은 리슈만편모충에서 확인된 통찰력이 포유류 시스템으로 번역될 수 있음을 시사합니다. 포유류 시스템으로 번역되지 않는 경우 리슈만편모충증 치료를 위한 치료 표적을 나타냅니다.
L. major promastigotes를 사용하여 막 복구 및 독소와의 상호 작용을 연구하려면 중간 처리량 기술이 필요합니다. 고해상도 라이브 셀 이미징을 사용하면 표지된 단백질과 막을 실시간으로 시각화할 수 있지만 처리량이 적고 세포 생존을 측정하지 못할 수 있습니다. 중간 처리량 생존력 분석에는 유세포 분석으로 측정한 염료 흡수, 미토콘드리아 활성 측정 또는 젖산 탈수소효소(LDH)와 같은 세포 단백질의 방출이 포함됩니다. 포유류 세포에서, LDH 분석은 세포 사멸을 정량적으로 측정하지 않는다20. 또한, LDH 방출 또는 미토콘드리아 활성과 같은 인구 기반 분석은 강력한 단일 세포 또는 다중 파라미터 분석을 허용하지 않습니다20. 대조적으로, 유세포분석 기반 분석은 다중 파라미터 단일 세포 분석을 가능하게 합니다(20). 그러나 이러한 분석은 독소 생물학 또는 L. 주요 프로마스티고테의 독소에 대한 반응을 이해하는 데 적용되지 않았습니다.
이 연구에서 SLO는 L. major promastigotes와 더 간단한 Tyrode 완충액을 배양하는 데 일상적으로 사용되는 M199 배지의 두 가지 다른 완충액에서 L. major의 스핑고지질 널 돌연변이의 원형질막 섭동을 이해하는 도구로 사용됩니다. 중간 처리량 유세포 분석 분석이 설명되고 독소 용량-반응 곡선을 생성하는 데 사용됩니다. 유동 세포분석 분석으로부터의 데이터는LC50 값을 결정하기 위해 로지스틱 곡선으로 모델링된다. 이러한 정보를 이용하여, SLO의 전분해 용량을 결정하여 웨스턴 블롯팅을 사용하여 MAPK 항체를 검증할 수 있다.
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Protocol
RG2 병원체 리슈만편모충 메이저 및 재조합 DNA의 사용 및 취급을 위해 모든 적절한 지침과 표준 미생물학적, 안전성 및 세포 배양 관행이 사용되었습니다. 살아있는 L. 전공 에 대한 모든 실험은 BSL-2 인증 실험실의 생물 안전 캐비닛에서 수행되었습니다. 이 작업은 텍사스 공대 기관 생물 안전위원회가 감독했습니다.
참고: 안전성 관점에서 살아있는 L. 주요 프로마스티고테는 위험 그룹 2 병원체입니다. 기관 생물안전 위원회(IBC)의 적절한 격리, 예방 조치 및 감독을 사용하여 처리합니다. 독성 물질에 대한 제도적 절차에 따라 독성 물질 및 화학 물질을 취급하십시오. 재조합 독소가 사용되는 경우 재조합 DNA 작업을 위해 IBC 승인 및 감독이 필요할 수 있습니다.
1. L. 주요 프로마스티고테스의 재배 및 준비
- 상동 재조합 또는 CRISPR 기반 방법13,21을 사용하여 이전에 설명한 L. 주요 유전 돌연변이를 얻거나 만들고 검증합니다. 녹아웃의 특이성을 보장하기 위해 플라스미드에 다시 추가된 유전자로 보완된 녹아웃을 사용하십시오.
- 야생형 L. 메이저 및 spt2- 프로마스티고테를 완전한 M199 배지에서 27°C에서 배양한다. 에피솜 애드백 세포(spt2-/+SPT2)를 완전한 M199와 10μg/mL G418에서 배양합니다( 표 1 및 재료 표 참조).
알림: L. 주요 세포 실험을 포함하는 전체 실험 설정은 BSL2 인증 생물안전 캐비닛에서 수행해야 합니다. - 이전에 수행된 L. 주요 성장 곡선 분석에 의해 결정된 바와 같이 완전한 M199 배지22에서 프로마스티고테를 배양합니다(2-8 x 106 cells/mL). 세포 독성을 위해 각 웰에 대해 1 x 10 5 세포와 염색 제어를 위한 5 x 105 세포를 계획하십시오. 웨스턴 블롯의 경우 웰당 2 x 107 셀을 계획하십시오.
참고: 두 가지 기술 복제로 세포 독성 분석을 수행합니다. - 적절한 세포 밀도를 확인하려면 분취량 (10-40 μL)의 프로 마스 티 고테를 동일한 부피의 고정 제 (3.7x PBS에서 1 % 파라 포름 알데히드)와 혼합하십시오. 고정된 시료 10μL를 혈구계의 양쪽에 로드합니다.
주의 : 포름 알데히드는 독성 화학 물질입니다. 유해 화학 물질에 대한 제도적 정책에 따라 취급하십시오. - 현미경을 사용하여 20x 배율로 세포 계수를 수행합니다. 혈구 측정기 중앙에있는 25 개의 작은 사각형에있는 모든 세포를 세십시오. 양쪽의 사각형에 대해 반복하고 카운트의 평균을 구합니다.
참고: 카운트 간의 변동이 >10이면 다시 계산하고 평균을 구합니다. 평균 개수가 <10 또는 >100이면 희석 및 재계수를 변경한 후 다음 수식을 사용하여 배양 밀도를 계산합니다.
(식 1)
예를 들어, 25개의 사각형에 평균 250개의 리슈만편모충 이 있는 경우 배양 밀도는 5 x 106 cells/mL입니다. - 계수 후 5 x 106 세포를 15mL 원뿔형 튜브로 옮기고 실온에서 8분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 10mL 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 세포 펠릿을 잠시 와동시킵니다. 동일한 튜브에 5mL의 1x PBS를 추가하고 3-6x를 부드럽게 뒤집어 세포를 세척합니다. 실온에서 8분 동안 1,500 x g 로 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다.
- 10mL 피펫을 사용하여 상청액을 버리고 5mL 피펫으로 실험에 사용된 5 mL의 배지(예: M199 또는 1x Tyrode's 완충액)에 5 x 10 6 세포 펠릿을 재현탁하여 최종 농도 1 x 106 cells/mL를 수득하였다.
(식 1)2. 세포독성 분석
- 실험 준비
- 앞서 설명한 바와 같이 독소를 정제하거나24, 또는 공급 업체로부터 독소를 구입하십시오. 일회용 분취량으로 분취하고 최대 80년 동안 -1°C에서 보관합니다. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.
- 인간 적혈구를 사용하여 각 독소에 대한 용혈 활성을 결정합니다( 재료 표 참조)24.
참고: 용혈 활성은 정제, 돌연변이 등으로 인한 활성의 차이를 제어하기 때문에 사용됩니다. 적혈구의 종 선택은 용혈 활성을 변경할 수 있습니다 (예를 들어, 인터메디신은 인간 적혈구를 필요로 한다). - 각 조건에 대해 2개의 기술 복제, 용량-반응 곡선에 대한 7개의 희석 및 무독소 대조군을 계획합니다.
참고: 야생형(WT), spt2- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테의 경우 하나의 V-바닥 96웰 플레이트에서 두 가지 처리를 테스트할 수 있습니다. 예를 들어 미디어에 대한 민감도를 비교할 수 있습니다(그림 1). V-바닥 플레이트 대신 1.2mL 마이크로타이터 튜브(재료 표 참조)를 사용할 수 있습니다. 세포분석기의 획득 시간으로 인해 한 번에 두 개 이상의 플레이트를 실행하는 것은 권장되지 않습니다. - 필요한 테스트 조건과 실험 목적에 따라 사용할 분석 버퍼를 결정합니다.
참고: 이 예에서는 M199와 생존 염료 프로피듐 요오드화물(PI)이 보충된 Tyrode의 버퍼라는 두 가지 분석 버퍼를 비교합니다. 혈청 내 콜레스테롤은 CDC 활동을 방해합니다24. - 치료된 유전자형의 상태와 수에 따라 필요한 독소의 양을 계산합니다. 50% 특이적 용해가 희석 곡선의 중간에 발생하는지 확인하십시오.
참고: CDC의 경우 2배 직렬 희석은 나중에 물류 모델링을 위한 좋은 범위를 제공합니다. spt2- 프로마스티고테의 경우 4,000 HU/mL SLO가 권장되는 시작 희석액입니다. 비활성 독소가 사용되는 경우 최고 용량에 해당하는 질량을 대신 사용할 수 있습니다. - 웰당 200 μL의 최종 부피를 계획하고 파이펫 오류를 고려하여 소량의 추가 부피(50-100 μL)를 추가합니다.
참고: 각각 중복으로 수행되는 3개의 유전자형으로 연속 희석을 위한 6개의 샘플이 있습니다. - 다음 공식을 사용하여 필요한 독소의 총량을 결정하십시오.
(식 2)
여기서 액티비티맥스는 사용된 최고 농도(HU/mL)입니다. TotalFinalVolume은 총 부피입니다 (6 개 샘플의 경우 200 x 6 + 100 = 1,300 μL). 활동 재고는 독소 스톡 (HU / mL)의 활성입니다. VolStockToxin은 필요한 독소 재고의 양입니다. - 실험에 필요한 충분한 분석 완충액을 준비합니다. 생존 염료와 Ca2+ 수준을 제어하는 데 필요한 Ca2+ 또는 EGTA로 기본 배지를 보충하십시오. 혼합 할 소용돌이.
참고: 예를 들어, Tyrode의 완충액 10mL마다 50μL의 2mg/mL PI와 200μL의 100mMCaCl2를 추가하여 각각 10μg/mL 및 2mM의 최종 농도를 제공합니다. - 생존성 염료 PI가 Cy5 또는 AlexaFluor647-접합 독소20,25를 사용하는 형광 결합 분석과 같이 사용된 다른 프로브와 충돌하지 않는지 확인합니다.
- 독소의 2x 용액을 만들기 위해 독소 희석을 계획하십시오. 1.5mL 원심분리 튜브에 분석 버퍼를 넣고 얼음에서 식힙니다. 분석을 시작하기 직전에 독소를 추가하십시오.
참고: 이 예에서는 1.3mL의 분석 버퍼가 상단 희석에 추가되고 650μL가 연속 희석에 추가되어 2x 독소 용액을 준비합니다.
- 실험
- 1.8단계에서 처리된 프로마스티고테 0.5mL를 별도의 튜브에 "염색되지 않은 대조군"으로 예약합니다.
알림: 이 샘플은 유세포분석기에서 게이팅을 설정하는 데 사용됩니다. - 2 mg/mL PI를 최종 농도 10 μg/mL에 첨가하여 나머지 프로마스티고테에 첨가합니다. 3 초 동안 소용돌이.
참고 : 처리 된 프로 마스티고트에 PI를 첨가 한 후,이 세포는 2.5 시간의 시간 동안 만 사용할 수 있습니다. 2.5 시간이 지나면 세포가 죽기 시작하고 결과가 잘못됩니다. - 1 x 105 (100μL/웰 기준) 처리된 프로마스티고트를 V-bottom 96웰 플레이트 또는 1.2mL 마이크로타이터 튜브의 각 웰에 추가합니다(그림 1). 플레이트 또는 튜브 랙을 보기에서 약 45° 각도로 얼음 위에 놓습니다. Leishmania promastigotes를 취급 할 때 생물 안전 캐비닛에서 작업을 수행하십시오.
- PI가 있는 분석 버퍼 100μL를 각 무독소 대조군(마지막 행)에 추가합니다. 색상이 더 어둡게 나타나는 총 부피가 200μL인 튜브를 시각적으로 식별하여 컨트롤이 올바르게 추가되었는지 확인합니다.
- -80°C에서 독소 분취량을 제거하고 얼음에서 해동하고 필요에 따라 풀링합니다. 단계 2.1.5에서 계산된 독소의 부피를 가장 높은 희석액에 첨가한다(단계 2.1.10에서 제조됨). 그런 다음 독소를 연속 희석합니다(그림 1). 혼합을 보장하기 위해 최소 8배 위아래로 피펫을 사용합니다.
알림: CDC는 실온에서 빠르게 비활성화되므로 얼음 위에서 수행하십시오. - 가장 낮은 독소 농도에서 시작하여 올바른 행(그림 1 및 그림 2)에 100μL의 독소를 빠르게 추가하고 모든 독소가 세포에 추가될 때까지 계속합니다.
- 밀봉 테이프로 플레이트를 밀봉하십시오. 37°C에서 30분 동안 배양합니다. 배양 기간 후, 플레이트를 포장하고 유세포 분석기로 운반한다.
- 1.8단계에서 처리된 프로마스티고테 0.5mL를 별도의 튜브에 "염색되지 않은 대조군"으로 예약합니다.
- 데이터 수집
- 유세포분석기( 재료 표 참조) 및 수집 소프트웨어를 제조업체의 지침 및 시설 정책에 따라 설정하십시오. 세포분석기에 대한 사전 교육 없이 유세포분석 절차를 수행하지 마십시오.
참고:이 예에서는 4-레이저 Attune NxT가 사용되었습니다. PI는 YL-1 채널(561nm 레이저에 의해 여기되고, 577 LP를 통과하고, 600 DLP에서 반사되고, 585/16 대역통과를 통해 필터링됨)에서 수집되었지만, PI의 광범위한 스펙트럼은 다른 채널에서 수집을 허용합니다. - 염색되지 않은 L. major promastigote 샘플을 사용하여 전방 및 측면 산란에 대한 게이트와 선택한 염료를 기반으로 초기 형광 매개 변수를 설정합니다.
- 자가 형광을 확인하기 위해 점도표에 필요한 경우 하나의 추가 매개 변수를 포함합니다(예: "얼룩 없음")(그림 3).
참고:이 예에서는 BL-1 채널(488nm 레이저로 여기, 495 DLP 및 503 LP 통과, 555 DLP에서 반사, 530/30 대역통과를 통해 필터링)이 사용되었습니다. - 단일 염색 대조군을 사용하여 생존 염료(이 연구에서는 PI) 및 형광 표지된 독소에 대한 게이트를 설정합니다. 마이크로 막힘에 대한 전방 산란 대 시간을 모니터링합니다.
알림: PI는 염색되지 않은 컨트롤 위의 모든 셀을 희미하게 염색합니다. 죽은 세포는 개체군 사이에 일시적으로 투과된 세포와 함께 쉽게 분리될 수 있습니다. - 세포분석기의 각 샘플에 대해 >10,000개의 게이트 이벤트를 수집합니다.
참고: 가장 민감한 것부터 가장 덜 민감한 것까지 읽는 것이 좋지만 읽기 순서가 샘플 결과에 미치는 영향을 확인하기 위해 수집 순서를 반대로 할 수 있습니다. - 데이터를 저장하고 분석을 위해 필요에 따라 내보냅니다.
- 유세포분석기( 재료 표 참조) 및 수집 소프트웨어를 제조업체의 지침 및 시설 정책에 따라 설정하십시오. 세포분석기에 대한 사전 교육 없이 유세포분석 절차를 수행하지 마십시오.
- 데이터 분석
참고: 이 연구에서는 해 찾기 플러그 인이 있는 Excel( 재료 표)는 데이터 분석에 사용되었습니다( 보충 파일 1).- 게이트 전체, 단일 세포 L. 주요 프로마스티고테는 필요에 따라 전방 및 측면 산란 및 시간에 게이팅합니다(그림 3). 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.
알림: 여기에 사용된 유세포분석기의 경우 면적 대신 높이가 권장되는 매개변수입니다. - 죽은 세포를 식별하고 게이트를 "PI 높음"으로 지정합니다. 중간 셀을 "PI 낮음"으로 게이트합니다. PI 높은 세포는 죽은 세포인 반면, PI 낮은 세포는 일시적으로 투과화된다26.
참고: PI 높은 셀은 일반적으로 음수 셀에서 2-3 로그 이동을 보여줍니다. - 데이터를 Excel로 내보냅니다. 샘플 이름/ID 및 %PI high를 가져와 킬링을 결정합니다.
참고: 형광 독소를 사용한 경우 살아있는, 일시적으로 투과된 집단 및 음성 집단의 중간 형광 강도(MFI)가 필요합니다. 과도적 투과화를 위해 %PI low를 내보낼 수 있습니다. - 두 기술 반복실험 사이의 각 조건에 대한 평균 %PI 최고치를 결정합니다.
알림: 형광 독소에 평균 MFI가 필요한 경우 이 값도 계산하십시오. - 다음 공식24,25를 사용하여 %PI 최고치에서 %특이적 용해를 계산합니다.
(식 3)
여기서 PIhighxpt는 실험 조건에 대한 %PI 최고입니다. PIhighctl은 무독소 대조군에 대한 %PI 최고입니다. - 용량-반응 곡선에 대한 독소 농도에 대한 %특이적 용해를 플로팅합니다(그림 4).
- 로지스틱 모델링을 위해 Excel에서 용량-반응 곡선을 구성합니다. 독소 농도 및 평균 %특이적 용해와 실험 세부 정보 및/또는 원시 %PI 높은 계산을 포함합니다(표 2).
- 해 찾기 추가 기능이 사용하도록 설정되어 있는지 확인합니다.
참고: 데스크톱 버전의 Excel에서 해 찾기를 사용하도록 설정하려면 파일 > 옵션 > 추가 기능으로 이동하여 해 찾기 상자를 선택합니다. 엑셀을 다시 시작합니다. - 4개 이상의 열에 "모델링됨", "잔차", "매개 변수" 및 "매개 변수 값"으로 레이블을 지정합니다. 첫 번째 열이 실험 매개 변수, 독소 농도 및 %특이적 용해에 해당하는지 확인합니다(표 2).
- "매개 변수" 열에 L, k, c, SUM 및 LC50 매개 변수를 추가합니다. "매개 변수 값" 열에 100, 0.05, 1,000 값을 입력하여 매개 변수 L, k 및 c를 초기화합니다.
- "modeled" 열에서 다음 수식을 사용하여 로지스틱 모델을 생성합니다.
(식 4)
L, k 및 c를 "매개 변수 값" 열의 해당 매개 변수가 포함된 셀로 설정합니다.
x를 독소 농도를 포함하는 세포로 설정합니다.
참고: 표 2, 셀 G4의 경우 수식은 =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - 이 방정식을 무독소 대조군을 제외한 모든 %특이적 Lysis 값에 적용합니다.
- "잔차" 열에서 다음 방정식을 사용하여 모델링된 수와 실제 특정 용해 간의 차이의 제곱을 계산합니다.
(식 5)
여기서 y는 실험적 %특이적 용해이고; m은 2.4.10-2.4.11 단계에서 계산 된 "모델링 된"열의 해당 값입니다. - "SUM" 옆의 "매개 변수 값" 열에서 잔차 열의 모든 값을 합산합니다.
- "LC50" 옆에 있는 "매개변수 값" 열에서 방정식을 초기화하여 결정된 값에서 LC50 을 계산합니다. 이것은 m = 50일 때 x 에 대해 식 4를 푸는 것입니다.
(식 6)
표 2의 경우 Excel 수식은 =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4입니다. - 데이터 탭에서 솔버를 엽니다. 목표 설정을 선택하여 계산된 잔차의 합을 포함하는 셀이 되도록 합니다. 최소로 설정합니다.
- L, k 및 c의 매개 변수 값에 대한 변수 셀을 변경합니다.
참고: 솔버는 "제약 조건이 없는 변수를 음수가 아닌 값으로 만들기"를 선택한 상태로 두면 더 잘 동작할 수 있습니다. - 음수 k 값의 경우 k에서 -1을 인수 분해하여 식4 및 식 6을 수정하여 k를 양수로 변경합니다. GRG 비선형 해결 방법을 사용합니다. 해결을 클릭합니다.
- 곡선을 확인하고 LC50 이 식 6을 사용하여 자동으로 계산되는지 확인합니다(표 2). %특이적 용해와 독소 농도에 대한 모델링을 모두 그래픽으로 플로팅하여 적합성을 확인합니다.
참고: 곡선에 대한R2 를 계산하여 확인할 수도 있습니다.
- 게이트 전체, 단일 세포 L. 주요 프로마스티고테는 필요에 따라 전방 및 측면 산란 및 시간에 게이팅합니다(그림 3). 유세포분석기에 권장되는 높이 또는 면적을 사용하십시오.
(식 2)
(식 3)
(식 4)
(식 5)
(식 6)3. 독소 도전 L. 주요 프로마스티고테의 단백질 분석
- L. 주요 프로마스티고테를 섹션 1에 설명된 대로 준비합니다.
- 5mL 피펫(예: 무혈청 M199)을 사용하여 원하는 분석 완충액 2mL에 2 x 107 WT, spt2- 및 spt2-/+SPT2 L. 주요 프로마스티고트를 재현탁합니다. 독소를 최종 아용해 농도에 첨가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
참고: 예를 들어, spt2- 프로마스티고테에 대한 SLO의 전분해 용량은 500 HU/mL입니다. - 다른 유전자형 및 무독소 대조군을 포함합니다.
- 프로마스티고테를 1,500 x g 에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 펠릿화합니다. 10 mL 피펫을 사용하여 상청액을 버립니다. 세포 펠릿이 들어있는 닫힌 튜브를 생물 안전 캐비닛의 그릴과 같은 불규칙한 표면을 가로 질러 빠르게 세 번 실행하여 세포 펠릿을 분해하십시오.
알림: 셀 펠릿은 육안으로는 거의 보이지 않습니다. - 사용 직전에 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼를 2-메르캅토에탄올로 재구성하고 셀 펠릿에 첨가하기 전에 10분 동안 95°C로 가열합니다. 뜨거운 1x SDS-PAGE 샘플 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 재현탁된 세포 펠릿을 95°C의 1x 샘플 버퍼에서 10분 동안 가열합니다.
참고: 샘플 버퍼에 가용화한 후 필요한 경우 샘플을 -20°C에서 장기간 보관하십시오. - 분해 젤을 준비하십시오. 과황산암모늄(APS)과 TEMED를 제외한 모든 성분을 15분 동안 탈기합니다.
- 젤을 주조하기 직전에 APS와 TEMED를 첨가하십시오. 분해 젤을 물로 조심스럽게 덮습니다. 분해능 겔이 중합되도록 ~30-45분 동안 기다립니다.
- 물을 따라 내고 스태킹 젤을 준비하십시오. 거품이 발생하지 않도록 주의하면서 스태킹 젤을 추가합니다. 관련 웰 수가있는 빗을 넣고 5 분 동안 중합하십시오. 남은 스태킹 젤을 사용하여 중합을 모니터링합니다.
- SDS-PAGE를 실행하기 위한 젤을 조립하고 챔버에 저장소 버퍼를 추가합니다.
- 웰당 각 시료 10μL 또는 단백질 래더 8μL를 로드합니다. 샘플이 분해능 젤에 들어갈 때까지 180V에서 실행한 다음 전압을 ~160V로 낮추고 염료 전면이 플레이트 가장자리에서 ~0.5cm가 될 때까지 실행합니다.
알림: 샘플이 바닥에 도달하는 데 걸리는 시간은 1-1.5 시간 사이에서 달라질 수 있습니다. 전압을 감소시킴으로써 시간이 길어질 수 있다. 전압을 0으로 낮추지 마십시오. 더 높은 전압은 젤 "미소"를 증가시키고 플레이트를 깨뜨릴 수 있습니다. - 젤을 Coomassie 염색(단백질 염색용) 또는 1x 전사 완충액(웨스턴 블로팅용)으로 옮깁니다. 쿠마시 염색의 경우 밤새 염색한 다음 염색, 이미징 및 건조합니다.
- 웨스턴 블롯의 경우 제조업체의 지침에 따라 전송 시스템을 준비하십시오.
- 습식 전사의 경우 차가운 1x 전사 버퍼와 사전 습윤 패드, 여과지 및 니트로셀룰로오스를 사용하십시오. 여기에 사용된 Bio-rad Protean III 시스템( 재료 표 참조)의 경우 여과지를 10cm x 7.5cm로 절단할 수 있습니다. 니트로 셀룰로오스를 9cm x 6.75cm로 자릅니다.
알림: 니트로셀룰로오스는 가연성이 높습니다. 화염 및 기타 잠재적 인 점화원을 피하십시오. - 패드, 여과지 및 니트로셀룰로오스로 전사 카세트를 배치합니다. 기포를 굴립니다. 젤을 조심스럽게 첨가하십시오.
- 여과지를 넣고 기포를 펼칩니다. 패드를 추가하고 카세트를 닫은 다음 올바른 방향으로 홀더에 삽입합니다(니트로셀룰로오스가 빨간색 단자를 향하도록 함). 교반 막대와 얼음 팩을 측면에 추가하고 차가운 1x 전달 버퍼로 저장소를 채웁니다. 110V에서 90분 동안 전송합니다.
알림: 전송 중에 발생하는 열은 전송에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 좋은 전송을 보장하려면 항상 콜드 1x 전송 버퍼를 사용하십시오. - 니트로셀룰로오스를 제거하고 Ponceau 용액으로 ~5분 동안 염색합니다. 초순수로 헹굽니다. 단백질 사다리를 연필로 표시하고 필요에 따라 얼룩을 다듬습니다. 남은 전송 버퍼를 사용하여 얼룩을 제거하십시오.
참고: 폰소는 여러 번 재사용할 수 있습니다. - 니트로셀룰로스를 4°C에서 1x TBST로 5% BSA 중 25mL로 차단하고, 밤새 진탕하였다. 그런 다음 블로킹 용액을 버리고 1x TBST의 1% BSA에 1차 항체(1:1,000)를 추가합니다. 4°C에서 밤새 흔든다.
참고: 1차 항체는 -20°C에서 저장하여 여러 번 재사용할 수 있습니다. - 니트로셀룰로오스를 흔들면서 3x TBST에서 각각 10분 동안 1회 세척합니다. 세척물을 버리고 10mL의 HRP-접합 2차 항체(1:10,000)를 1x TBST의 1% BSA에 추가합니다. 실온에서 1 시간 동안 흔들어주십시오. 니트로셀룰로오스를 흔들면서 3x TBST에서 각각 10분 동안 1회 세척합니다.
- 니트로셀룰로오스를 이미징하기 직전에 ECL 시약을 준비합니다. 이미징 직전에 TBST를 디캔트하고 ECL 시약을 니트로셀룰로오스에 추가합니다. 1분 동안 흔듭니다. 젤을 이미지화합니다.
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Representative Results
M199에 비해 Tyrode의 버퍼에서 SLO에 대한 프로마스티고트 민감도 증가
L. 주요 프로마스티고테의 SLO 민감도를 상이한 분석 완충액 간에 비교하였다. 야생형, spt2- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테는 유세포분석기에서 분석하기 전에 30분 동안 2mMCaCl2가 보충된 무혈청 M199 또는 Tyrode의 완충액에서 SLO로 도전되었습니다. 분석에 적합한 기생충은 전방/측면 산란 프로파일에 의해 확인된 단일 세포였다(도 3A,B). 데이터는 채널 BL1 (488 여기, 530/30 방출 필터)을 자동 형광 대조군으로 사용하고 PI에 대해 YL1 (561nm 여기, 585/16 방출 필터)을 사용하여 수집하였다. BL1은 잠재적인 자가형광 또는 보상 문제를 식별하는 데 사용되었습니다(그림 3C-E의 x축). 561nm 라인을 사용하여 PI에서 BL1 채널로의 블리드 스루를 줄였습니다. 각 조건에 대해 죽은 세포의 분율을 결정하고 % 특이 적 용해를 결정했습니다. 야생형 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테는 무혈청 M199에서 SLO에 내성이 있었지만 Tyrode의 완충액에서는 경미한(<20%) 특이적 용해가 있었습니다(그림 4A). 스핑고지질이 결핍된 spt2-프로마스티고테는 무혈청 M199와 Tyrode 완충액 모두에서 SLO에 민감했습니다(그림 4). 무혈청 M199와 비교하여 Tyrode의 완충액에서 감도의 증가를 정량화하기 위해 용량-반응 곡선을 로지스틱 모델에 적합시키고 각 조건에 대해 LC50을 계산했습니다(그림 4B). spt2-프로마스티고테는 M199보다 Tyrode의 완충액에서 SLO에 약 8배 더 민감했습니다(그림 4B). 이러한 데이터는 독소 민감도가 사용된 완충액에 따라 달라질 수 있음을 보여줍니다. 곡선 피팅을 사용하면 전체 용량-반응 곡선의 변화를 비교할 수 있습니다. 따라서, 유세포분석은 중간 처리량 분석이 상이한 조건 하에서 L. major 프로마스티고테의 독소 민감도를 비교하는 것을 가능하게 한다.
독소 챌린지와 무관한 L. 전공의 MEK 경로 활성화
세포독성 분석에서 세포 생존에 대한 단일 세포 데이터는 전분해 독소 용량에서 다운스트림 분석을 가능하게 합니다. 예를 들어, L. major 는 독소 챌린지 후 웨스턴 블로팅에 의해 생화학적 경로에 대해 분석될 수 있다. MEK 경로는 포유동물 세포에서 막 복구 동안 활성화됩니다6. 이 경로가 L. major의 SLO 챌린지 후에 활성화되는지 또는 상업적으로 이용 가능한 항체가 L. major MAPK 동족체를 인식하는지 여부는 알려져 있지 않습니다 . WT, spt2- 및 spt2-/+SPT2 프로마스티고테를 SLO의 아용해(500HU/mL) 용량으로 도전하고 웨스턴 블로팅으로 분석했습니다. L. 주요 프로마스티고테에서 phospho-MEK에 대해 ~120kDa 밴드가 관찰되었습니다(그림 5). 총 MEK의 경우 ~120kDa 및 ~55kDa의 대역이 관찰되었으며(그림 5), 이는 각각 MRK1 및 LmxMKK의 크기와 일치합니다. Phospho-ERK는 유사한 밴드를 검출한 반면, ERK 항체 염색은 이 분석에서 견고하지 않았습니다(그림 5). 리포포스포글리칸(LPG)과 튜불린도 로딩 대조군으로 블롯지되었습니다. 이러한 데이터는 L. major에서 사용하기 위한 항체 검증의 중요성을 보여줍니다.
그림 1: 96웰 플레이트는 세포독성 분석을 위한 정렬된 설정을 가능하게 합니다. 세포 독성 분석은 각각 2 개의 기술 복제물로 구성된 6 개의 컬럼으로 나뉩니다. 컨트롤을 사용하면 플레이트당 두 가지 조건을 테스트할 수 있습니다. 이 예에서, 무혈청 M199에 재현탁된 L.major 프로마스티고테는 Tyrode의 완충액에 있는 것과 비교됩니다. 유전자형은 야생형(WT)(녹색), spt2-(빨간색) 및 spt2-/+SPT2(파란색)의 순서를 따릅니다. 독소(SLO)는 농도가 플레이트 상단의 최고 농도에서 하단으로 흐르도록 추가되어 마지막 행은 무독소 대조군으로 남습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 일관된 설정으로 재현 가능한 세포독성 결과가 가능합니다. 필요한 독소의 양을 계산한 후, 2x 용액에 필요한 분석 완충액의 부피를 준비합니다. 생존 염료 (PI)와 CaCl2 를 필요에 따라 첨가하고 완충액을 1.5mL 튜브에 분주합니다. 세척 및 분석 완충액에서 재현탁시킨 후, 동일한 수의 L. 주요 프로마스티고테를 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 독소는 분석 완충액에 첨가되고 세포에 첨가되기 직전에 최고 독소 용량 (1st tube)에서 최저 용량 (7st tube)까지 순차적으로 희석됩니다. 독소는 가장 낮은 독소 용량 (7 번째 줄)에서 플레이트의 바닥에서 시작하여 가장 높은 용량 (1 번째 줄)까지 작동하는 96 웰 플레이트의 세포에 추가됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 게이팅 전략은 살아있는 세포 집단과 죽은 세포 집단을 구분합니다. L. PI로 염색되고 SLO로 도전된 주요 프로마스티고테를 유세포분석법으로 분석하였다. (ᄀ,ᄂ) 게이팅 전략은 전방 및 측면 산란을 기반으로 전체 L. major에서 단일 세포를 식별합니다. (씨-에) 다음으로 PI 염색을 평가하고 세포를 PI 높음, PI 낮음 및 PI 음성 집단으로 게이팅합니다. (C) 독소 없음, (D) 1,000 HU/mL 및 (E) 4,000 HU/mL SLO에 대한 대표적인 데이터가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Tyrode의 완충액은 M199에 비해 L. major 프로마스티고테의 민감도를 향상시킵니다. 야생형 (WT), spt2- 및 spt2-/+SPT2 L . 2 mMCaCl2 가 보충된 무혈청 M199 또는 티로드 완충액 중의 주요 프로마스티고테를 30분 동안 37°C에서 지시된 농도로 SLO로 도전하고, PI 흡수를 유세포분석법에 의해 분석하였다. %특이적 용해를 계산하였다. 로지스틱 모델을 구축하고,LC50 을 spt2- 돌연변이체에 대해 계산하였다. 그래프는 (A) SEM 평균± 또는 (B) 세 가지 독립적인 실험의 개별 실험을 표시합니다. Welch의 보정을 사용한 학생의 쌍을 이루지 않은 t-검정이 LC50 값에 사용되었습니다. ** p < 0.01 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: Phospho-ERK 및 phospho-MEK1/2는 스핑고지질이나 독소 챌린지와 독립적으로 L. 주요 단백질을 검출합니다. 야생형 (WT), spt2- 및 spt2-/+SPT2 L. 주요 프로마스티고테는 2mM CaCl2가 보충된 무혈청 M199에서 500HU/mL SLO의 유무에 관계없이 37°C에서 30분 동안 도전되었습니다. 세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분해하고, 니트로셀룰로스로 옮기고, 포스포-MEK (pMEK), 총 MEK, 포스포-ERK (pERK), 총 ERK, 리포포스포글리칸 (LPG) 또는 튜불린에 대해 프로빙한 후, HRP-접합된 2차 항체 및 ECL에 대해 프로빙하였다. 두 개의 독립적 인 실험으로부터의 대표적인 블롯이 각각의 경우에 도시된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 버퍼 및 배지 조성. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 2: Excel 계산을 위한 샘플 레이아웃. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 수식이있는 Excel 스프레드 시트. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 인간 병원균 리슈만편모충 전공 을 모델 시스템으로 사용하여 PFT의 분자 메커니즘과 기능을 연구하는 방법을 설명했습니다. 단일 세포 생존율을 측정하기 위한 배지-처리량 유세포분석-기반 세포독성 분석법이 개발되었다. LC50 값은 로지스틱 모델링을 사용하여 용량-반응 곡선에서 계산할 수 있기 때문에 모집단 수준에서 생존력이 정량적입니다. 원리 증명으로 유세포 분석 분석을 사용하여 배지의 선택이 SLO에 대한 야생형 및 스핑고지질 결핍 L.major 민감도를 변경할 수 있음을 설명하고 각 배지에서 과용해 독소 용량을 결정했습니다. 다운스트림 분석의 원리 증명으로, 포스포-MAPK 및 포스포-ERK 항체는 독소 챌린지 동안 L. 주요 프로마스티고테에서 테스트되었습니다. 전반적으로, L. 주요 프로마스티고테스는 세포에 대한 독소 매개 손상의 메커니즘과 기능을 더 잘 이해하는 데 사용할 수 있는 병원적으로 관련이 있고 유전적으로 다루기 쉬운 모델 시스템입니다.
유세포분석 분석은 높은 유연성을 제공합니다. 원하는 경우 다른 생존 염료를 PI로 대체할 수 있습니다. 포유동물 세포에서, 다양한 생존율 염료20에 대한 보고 능력에서 차이가 관찰되지 않았다. 독소의 선택, L. 주요 유전자형, 임의의 치료법의 첨가, 및 분석 완충액의 선택은 필요에 따라 다양할 수 있다. 독소 결합은 사용된 독소가 Cy5와 같은 형광단에 접합되는 경우 세포독성과 병행하거나 세포 독성 대신에 평가할 수 있습니다. L. 주요 유전자형의 경우 표현형이 녹아웃된 유전자 때문인지 확인하기 위해 보완된 균주를 포함하는 것이 중요합니다. 이 개념 증명 연구에서 L. major, M199 성장에 사용 된 기본 배지는 Tyrode의 완충액보다 L. major promastigotes에 더 많은 보호를 제공했습니다. Tyrode의 완충액은 L. major promastigotes를 시험관 내에서 전파하는 데 사용되는 기저 배지 인 무혈청 M199의 사용과 비교하여 L. major promastigotes의 spt2- 돌연변이 의 민감도를 증가 시켰습니다. 이것은 M199에 하나 이상의 세포 보호 성분이 있음을 시사합니다. 2개의 잠재적인 세포보호제는 글리신 또는 알라닌이며, 이는 다른 포유동물 시스템에서 세포보호적이다(27,28). 전반적으로 유세포분석 세포독성 분석은 다양한 독소, 상태 및 기생충 유전자형을 분석하기 위한 유연한 플랫폼을 제공합니다.
유세포분석 분석과 로지스틱 모델링의 결합은 PFT에 대한 세포 감수성에 대한 향상된 정보를 제공합니다. 첫째, 활성 독소에 대해 질량 대신 용혈 단위가 사용되었습니다. 이를 통해 다양한 독소 제제와 일관된 분석 결과에 대한 데이터를 정규화하고 독소와 표적 간의 사멸을 직접 비교할 수있었습니다. 치사율에 대한 독소의 기여도를 분석하기 위해 특이적 용해가 사용되었지만 각 조건에 필요한 대조군은 기준선 사멸에 대한 정보를 제공합니다. 약제가 특히 독성이있는 경우 이러한 대조군에 나타납니다. 여러 농도에 걸친 특이적 용해는 용량-반응 곡선의 생성을 가능하게 합니다. 용량-반응 곡선은 독소 활성을 해석하는 데 필수적입니다. 많은 경우 실험실은 단일 농도에서 독소 감수성의 차이를 보고합니다. 선택된 용량-반응 곡선의 부분에 따라, 이러한 차이는 원하는 감도 또는 저항의 임의의 인상을 주기 위해 왜곡될 수 있다. 전체 용량-반응 곡선의 분석은 로지스틱 모델링을 통해 수행될 수 있다. 로지스틱 모델링은 쉽게 구할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 간단하며 LC50, 곡선의 가파름(k) 및 최대 용해(L)에 대한 추가 정보를 제공합니다. 이러한 모든 매개변수의 차이를 사용하여 곡선 간의 통계적 유의성을 결정할 수 있습니다. 최대 용해에 대한 변화는 부분 활성 독소, 비활성 독소 또는 내성 세포 유형에 유용할 수 있습니다. 전반적으로, 세포독성의 변화를 측정하기 위한 정량적 방법이 제공되었다.
정량적 중간 처리량 유세포분석 세포독성 분석법을 사용할 때의 이점에도 불구하고 이 분석을 사용할 때 고려해야 할 주의 사항이 있습니다. 특히, 혈청이 부족하면 잠복기가 1-2 시간으로 제한됩니다. 나중에 더 높은 배경 죽음은 결과의 해석을 복잡하게 만듭니다. 혈청의 콜레스테롤이 CDC24를 억제하기 때문에 혈청 제거가 CDC에 필요합니다. 다른 혈청 인자도 독소에 대한 세포 민감성을 변화시킬 수 있습니다. 또 다른 과제는 분석에 사용되는 칼슘의 농도입니다. 막 복구 분석은 일반적으로 세포외 Ca2+를 모방하기 위해 2mMCa2+를 사용하지만, 고칼슘 완충액은 유세포분석기에 칼슘 침착을 초래할 위험이 있으며, 이는 세포 응집을 유발하거나 미세유체공학을 막을 수 있습니다. Hellmanex III(재료 표 참조) 및/또는 표백제로 세척하기 전에 2mM EDTA로 세포분석기를 청소하면Ca 2+ 축적이 감소합니다. 마지막으로주의 사항은 물류 모델링입니다. 솔버 플러그인은 때때로 최적의 피팅을 제공하지 않는 로컬 최소값에 "고정"됩니다. 이러한 경우 파라미터를 수동으로 변경하고 솔버를 다시 실행하면 모델이 개선될 수 있습니다. 전체 로지스틱 곡선이 제공되지 않으면 솔버는 L에 대해 큰 값을 외삽할 수도 있습니다. 완전한 로지스틱 곡선을 생성하기에 충분한 데이터 포인트를 수집하는 것이 중요합니다. 로지스틱 곡선으로 용량-반응 곡선을 쉽게 모델링할 수 없는 경우LC50 값을 정의하지 않은 상태로 두거나(예: > 4,000HU/mL) 다른 곡선이 데이터에 적합할 수 있습니다.
SLO의 아 용해 용량이 결정되면 SLO에 대한 세포 반응을 테스트 할 수 있습니다. MEK 활성화가 포유류 세포에서 SLO에 대한 복구의 ~70%를 제어하기 때문에 L. major의 MEK-ERK 경로에서 항체를 테스트하여 원리 증명이 제공되었습니다6. 포스포-MEK 항체는 MRK1과 일치하는 ~120kDa 대역을 검출했습니다. 55 kDa에서 예상되는 LmxMKK 상동체의 강력한 인산화는 검출되지 않았다. 그러나 MEK 항체는 MRK1 및 LmxMKK 모두와 일치하는 대역을 검출했습니다. phospho-ERK 항체는 또한 ~ 120 kDa 및 55 kDa에서 밴드를 검출했다. 55kDa 대역은 MAPK5의 크기와 일치합니다. ERK 항체는 이 분석에서 견고하지 않았습니다. 이러한 단백질의 정체를 확인하기 위해서는 질량 분석법 또는 다른 방법이 필요합니다. MEK1/2 및 ERK1/2의 리슈만성 동족체의 인산화는 독소 챌린지와 독립적으로 검출되었습니다. 전반적으로, 유세포분석에 의해 결정된 독소의 전분해 용량을 웨스턴 블로팅과 같은 다운스트림 분석에서 키나아제를 검출하는 데 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석에도 주의 사항이 있습니다. 특히, 대부분의 상업용 항체는 리슈만 단백질에 대해 특이적으로 제기되지 않습니다. 대신, 다른 유기체의 상동체를 표적으로 하는 항체를 먼저 검증하고 적정해야 합니다. 샘플 준비는 최종 블롯 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 샘플 완충액 중의 환원제인 2-메르캅토에탄올은 SDS 시료 완충액을 세포 펠릿에 첨가하기 직전에 첨가할 필요가 있다. 재현 된 세포 펠릿은 -20 ° C에서 보관할 수 있지만 많은 동결 / 해동 사이클에서 살아남지 못합니다. 리슈만편모충 의 MAPK와 같은 상동 단백질을 표적으로 하는 1차 항체는 웨스턴 블롯의 고품질 밴드를 위해 밤새 블롯과 함께 배양해야 합니다.
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Disclosures
이 연구는 국립 보건원의 국립 알레르기 및 전염병 연구소가 PAK 및 KZ (co-I)에 R21AI156225를, KZ (co-I)에 R01AI139198을 부여했습니다. CH는이 연구 기간 동안 제공된 조교에 대해 생물 과학과를 인정하고자합니다.
자금 지원 기관은 연구 설계에 아무런 역할도 하지 않았습니다. 데이터의 수집, 분석 또는 해석; 원고 작성시; 결과를 발표하기로 한 결정도 아닙니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 자금 지원 기관의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 저자는 경쟁적인 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 원고에 대한 비판적 검토에 대해 Keyel 및 Zhang 연구실 구성원에게 감사하고 싶습니다. 저자는 시설 사용에 대해 예술 과학 대학 현미경에 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
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