Summary

Células Semelhantes à Microglia Humana: Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas e Ensaio de Fagocitose de Células Vivas In Vitro usando Sinaptossomos Humanos

Published: August 18, 2022
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Summary

Este protocolo descreve o processo de diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) em células semelhantes à micróglia para experimentação in vitro . Também incluímos um procedimento detalhado para gerar sinaptossomos humanos a partir de neurônios motores inferiores derivados de iPSC que podem ser usados como substrato para ensaios de fagocitose in vitro usando sistemas de imagem de células vivas.

Abstract

A micróglia são as células imunes residentes de origem mielóide que mantêm a homeostase no microambiente cerebral e tornaram-se um jogador-chave em múltiplas doenças neurológicas. Estudar a micróglia humana na saúde e na doença representa um desafio devido ao suprimento extremamente limitado de células humanas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) derivadas de indivíduos humanos podem ser usadas para contornar essa barreira. Aqui, é demonstrado como diferenciar iPSCs humanas em células semelhantes à micróglia (iMGs) para experimentação in vitro . Esses iMGs exibem as propriedades esperadas e fisiológicas da micróglia, incluindo morfologia semelhante à microglia, expressão de marcadores adequados e fagocitose ativa. Além disso, é fornecida documentação para isolar e marcar substratos de sinaptossomos derivados de neurônios motores inferiores derivados de iPSC humanos (i3LMNs). Um ensaio de imagem longitudinal de células vivas é usado para monitorar o engolfamento de sinaptossomos humanos marcados com um corante sensível ao pH, permitindo investigações da capacidade fagocítica do iMG. Os protocolos aqui descritos são amplamente aplicáveis a diferentes campos que estão investigando a biologia da micróglia humana e a contribuição da micróglia para a doença.

Introduction

As microglias são as células imunes residentes no sistema nervoso central (SNC) e desempenham um papel crucial no desenvolvimento do SNC. A micróglia também é importante no cérebro adulto para manter a homeostase e responder ativamente a processos de trauma e doença. Evidências cumulativas mostram que a micróglia é um dos principais contribuintes para a patogênese de múltiplas doenças neurodesenvolvimentais e neurodegenerativas 1,2. Embora o conhecimento atual sobre a biologia microglial tenha sido predominantemente derivado de modelos de camundongos, estudos recentes têm elucidado diferenças importantes entre a micróglia murina e humana, ressaltando a necessidade de desenvolvimento de tecnologias para estudar a genética e as funções biológicas da micróglia humana 3,4. O isolamento da micróglia do tecido primário dissecado pode modificar severamente as propriedades da micróglia5, potencialmente confundindo os resultados adquiridos com essas células. O objetivo geral deste método é diferenciar as iPSCs humanas em iMGs, fornecendo assim um sistema de cultura celular para estudar a micróglia humana sob condições basais. Além disso, um ensaio de fagocitose usando um sistema de modelo totalmente humano é incluído aqui como um meio de estudar a funcionalidade dos iMGs, tanto como uma medida de controle de qualidade quanto para avaliar a disfunção de iMG no contexto da doença.

Múltiplos protocolos para diferenciação da micróglia a partir de iPSCs têm surgido recentemente na literatura 6,7,8,9,10. As desvantagens potenciais de alguns protocolos incluem períodos prolongados ou longos de diferenciação, a adição de múltiplos fatores de crescimento e/ou procedimentos experimentais complexos 6,9,10. Aqui, demonstra-se um método de diferenciação “user-friendly” que recapitula aspectos da ontogenia da micróglia por meio da diferenciação de iPSCs em células precursoras denominadas precursoras primitivas de macrófagos (PMPs)7,11. Os PMPs são gerados conforme descrito anteriormente, com algumas otimizações aqui apresentadas12. Os PMPs imitam macrófagos derivados de saco vitelino independentes de MYB, que dão origem à micróglia durante o desenvolvimento embrionário, invadindo o cérebro antes do fechamento da barreira hematoencefálica13. Para diferenciar terminalmente PMPs em iMGs, utilizamos um método de monocultura rápido e simplificado baseado em protocolos de Haenseler et al. e Brownjohn et al., com algumas modificações para gerar um método eficiente de diferenciação de micróglias no qual os iMGs expressam robustamente marcadores enriquecidos com microglia 7,8. Este método de diferenciação pode ser reproduzido em laboratórios com experiência na cultura de iPSCs e com objetivos de pesquisa com o objetivo de estudar a biologia da micróglia usando um sistema de modelo humano.

A micróglia derivada da iPSC representa uma fonte biologicamente relevante de micróglia humana para experimentação in vitro e é uma ferramenta importante para investigar as funções canônicas microgliais, incluindo a fagocitose. As micróglias são os fagócitos profissionais do cérebro e do SNC, onde limpam detritos celulares, proteínas agregadas e mielina degradada14. A micróglia também atua no remodelamento sináptico por engolfamento de sinapses e na defesa contra infecções externas por meio da fagocitose de patógenos15,16. Neste protocolo, a fagocitose por iMGs é avaliada usando sinaptossomos humanos como material para engolfamento de iMG. Para este fim, uma descrição para isolar sinaptossomos derivados de i3LMNs humanos é descrita. Os sinaptossomos humanos derivados de LMN i3são marcados com um corante sensível ao pH que permite a quantificação de sinaptossomos localizados dentro de compartimentos ácidos durante o processamento e degradação de fagossomos in vitro. Um ensaio de fagocitose usando microscopia de células vivas é mostrado para monitorar o processo dinâmico de engolfamento da micróglia em tempo real. Este ensaio funcional estabelece uma base para investigar possíveis defeitos na fagocitose microglial na saúde e na doença usando um sistema humano completo.

Protocol

NOTA: Todos os reagentes utilizados neste protocolo devem ser estéreis, e todas as etapas devem ser realizadas em um gabinete de biossegurança sob condições estéreis. Todas as linhas iPSC, bem como os meios de manutenção e diferenciação, estão descritos na Tabela de Materiais. O método de diferenciação da micróglia ilustrado a seguir baseia-se em protocolos publicados anteriormente7,8,12 com novas modificações aqui descritas.<sup…

Representative Results

Para gerar iMGs utilizando esse protocolo, é importante começar com iPSCs indiferenciadas que apresentem morfologia de colônia compacta com bordas bem definidas (Figura 2A). As iPSCs dissociadas mantidas conforme descrito na seção de formação de EB formarão agregados esféricos, denominados EBs, que crescerão em tamanho até o dia 4 de diferenciação (Figura 2B). Uma vez que os EBs são coletados e banhados nas condições apropriadas para a geração …

Discussion

O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método eficiente para obter células semelhantes a micróglias derivadas de iPSC em ~6-8 semanas com alta pureza e em um rendimento suficiente para realizar experimentos de imunofluorescência e outros ensaios que requerem um maior número de células. Este protocolo produziu até 1 × 106 iMGs em 1 semana, o que permite a extração de proteínas e RNA e análises a jusante correspondentes (por exemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espectrometria de m…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Michael Ward por fornecer a linha WTC11 hNIL iPSC para diferenciação de neurônios motores e aos Jackson Laboratories por fornecer a linha KOLF2.1J WT clone B03 iPSC usada para diferenciação de micróglias. Também agradecemos a Dorothy Schafer por seu apoio durante a implementação dos protocolos, Anthony Giampetruzzi e John Landers por sua ajuda com o sistema de imagem de células vivas, bem como Hayden Gadd por suas contribuições técnicas durante as revisões e Jonathan Jung por sua colaboração neste estudo. Este trabalho foi apoiado pelo Dan and Diane Riccio Fund for Neuroscience da UMASS Chan Medical School e pelo Angel Fund, Inc.

Materials

Antibodies for immunofluorescence analysis
anti-IBA1 rabbit antibody Wako Chemical USA NC9288364 1:350 dilution
anti-P2RY12 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA014518 1:50 dilution
anti-TMEM119 rabbit antibody Sigma-Aldrich HPA051870 1:100 dilution
Antibodies for Western blot analysis
anti-β-Tubulin rabbit antibody Abcam ab6046 1:500 dilution
anti-Synaptophysin (SYP) rabbit antibody Abclonal A6344 1:1,000 dilution
anti-PSD95 mouse antibody Millipore MAB1596 1:500 dilution
Borate buffer components
Boric acid (100 mM) Sigma B6768
Sodium bicarbonate (NaHCO3) BioXtra Sigma-Aldrich S6297-250G
Sodium chloride (75 mM) Sigma  S7653
Sodium tetraborate (25 mM) Sigma 221732
Cell culture materials
6-well plates Greiner Bio-One 657160
40 μm Cell Strainers  Falcon 352340
100 mm x 20 mm Tissue Culture Treated CELLTREAT 229620
Cell Lifter, Double End, Flat Blade & Narrow Blade, Sterile CELLTREAT 229305
low adherence round-bottom 96-well plate Corning 7007
Primaria 24-well Flat Bottom Surface Modified Multiwell Cell Culture Plate Corning 353847,
Primaria 6-well Cell Clear Flat Bottom Surface-Modified Multiwell Culture Plate Corning 353846
Primaria 96-well Clear Flat Bottom Microplate Corning 353872
Cell dissociation reagents
Accutase  Corning 25058CI dissociation reagents used for lower motor neuron differentiation
TrypLE reagent Life Technologies 12-605-010 dissociation reagents used for microglia differentiation
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
Coating reagents for cell culture
Matrigel GFR Membrane Matrix Corning™ 354230 Referred as to extracellular matrix coating reagent
CellAdhere Laminin-521 STEMCELL Technology 77004 Referred as to laminin 521
Poly-D-Lysine Sigma P7405 Reconstitute to 0.1 mg/mL in borate buffer
Poly-L-Ornithine Sigma  P3655 Reconstitute to 1 mg/mL in borate buffer
Components of iPSC media
 mTeSR Plus Kit STEMCELL Technology 100-0276 To prepare iPSC media mixed the components to 1x
Components of EB media
BMP-4 Fisher Scientific PHC9534 final concentration 50 ng/mL
iPSC media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 µM
SCF PeproTech 300-07 final concentration 20 ng/mL
VEGF PeproTech 100-20A final concentration 50 ng/mL
Components of PMP base media
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
X-VIVO 15 Lonza 12001-988 final concentration 1x
Components of PMP complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-3 PeproTech 200-03 final concentration 25 ng/mL
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 100 ng/mL
PMP base media final concentration 1x
Components of iMG base media
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634010 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122 final concentration 100 U/mL
Components of iMG complete media
55 mM 2-mercaptoethanol Gibco 21985023 final concentration 55 µM
IL-34 PeproTech or Biologend 200-34 or 577904 final concentration 100 ng/mL
iMG base media final concentration 1x
M-CSF PeproTech 300-25 final concentration 5 ng/mL
TGF-β PeproTech 100-21 final concentration 50 ng/mL
Components of Induction base media
DMEM/F12 with HEPES Gibco 11330032 final concentration 1x
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
Components of Complete induction media
Compound E Calbiochem 565790 final concentration 0.2 μM and reconstitute stock reagent to 2 mM in 1:1 ethanol and DMSO
Doxycycline Sigma D9891 final concentration 2 μg/mL and reconstitute stock reagent to 2 mg/mL in DPBS
Induction base media final concentration 1x
ROCK inhibitor Y27632 Fisher Scientific BD 562822 final concentration 10 μM
Components of Neuron media
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401 final concentration 1x for media and suplemment
GlutaMAX Gibco 35050061 final concentration 1x
N2 supplement, 100x Gibco 17502-048 final concentration 1x
Non-essential amino acids (NEAA), 100x Gibco 11140050 final concentration 1x
iPSC lines used in this study
KOLF2.1J: WT clone B03 The Jackson Laboratories
WTC11 hNIL National Institute of Health
Synaptosome isolation reagents
BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific Pierce 23227
dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma D2650
Syn-PER Synaptic Protein Extraction Reagent Thermo Scientific 87793 Referred as to cell lysis reagent for isolation of synaptosomes
Phagocytosis assay dyes
NucBlue Live Ready reagent Invitrogen  R37605
pHrodo Red, succinimidyl ester ThermoFisher Scientific  P36600 Referred as to pH-sensitive dye
Other cell-culture reagents
Trypan Blue, 0.4% Solution AMRESCO INC K940-100ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma 22144-77-0
BrdU Sigma B9285 Reconstitute to 40 mM in sterile water
Cytochalasin D Sigma final concentration 10 µM
DPBS with Calcium and magnesium Corning 21-030-CV
DPBS without calcium and magnesium Corning 21-031-CV Referred as to DPBS
KnockOut  DMEM/F-12 Gibco 12660012 Referred as to DMEM-F12 optimized for growth of human embryonic and induced pluripotent stem cells
Laminin Mouse Protein, Natural Gibco 23017015 Referred as to laminin
Software and Equipment
Centrifuge Eppendorf Model 5810R
Cytation 5 live cell imaging reader Biotek
Gen5 Microplate Reader and Imager Software Biotek version 3.03
Multi-Therm Heat-Shake Benchmark refer as tube shaker
Water sonicator Elma Mode Transsonic 310

Referências

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Citar este artigo
Funes, S., Bosco, D. A. Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes. J. Vis. Exp. (186), e64323, doi:10.3791/64323 (2022).

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