Summary

自然免疫細胞死を評価するためのカスパーゼ活性化の評価

Published: January 20, 2023
doi:

Summary

このプロトコルは、パイロトーシス、アポトーシス、ネクロプトーシス、およびパンノプトーシスなどの細胞死経路の開始を決定するための感染、無菌の侮辱、および癌のin vitro および in vivo (マウス)モデルの両方に応答して、カスパーゼ活性化(カスパーゼ-1、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11)を評価するための包括的な方法について説明しています。

Abstract

自然免疫は、病原体や無菌の侮辱に反応して重要な第一線の防御を提供します。この応答の重要な機構的要素は、感染または損傷した細胞を排除し、免疫応答を伝播するための自然免疫プログラム細胞死(PCD)の開始です。しかしながら、過剰なPCDは炎症および病理学と関連している。したがって、PCDの活性化と調節を理解することは、自然免疫応答を特徴付け、疾患スペクトル全体で新しい治療標的を特定するための中心的な側面です。

このプロトコルは、アポトーシス、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなどの多様なPCD経路に関連することが多いシステイン依存性プロテアーゼのファミリーであるカスパーゼをモニタリングすることにより、自然免疫PCD活性化を特徴付ける方法を提供します。最初の報告では、カスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10が開始カスパーゼとして、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7がアポトーシスのエフェクターカスパーゼとして特徴付けられましたが、後の研究では、炎症性カスパーゼ、カスパーゼ-1、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、およびカスパーゼ-11がパイロトーシスを引き起こすことがわかりました。カスパーゼと他の自然免疫および細胞死分子との間には、以前に定義されたPCD経路全体で広範なクロストークがあることが現在知られており、自然免疫とPCDの機構的理解における重要な知識ギャップを特定し、PANoptosisの特性評価につながります。PANoptosisは、他の細胞死経路からのカスパーゼを含む成分を組み込んだPANoptosome複合体によって調節されるユニークな自然免疫炎症性PCD経路です。

ここでは、様々な刺激に応答したカスパーゼの活性化を評価するための方法が提供される。これらのメソッドは、活性化カスパーゼがタンパク質分解切断を受け、最適な抗体とブロッティング条件を使用したウェスタンブロッティングによって視覚化できるため、 in vitro および in vivoの両方でPCD経路の特性評価を可能にします。同じ細胞集団からの複数のカスパーゼの活性化の評価を可能にするプロトコルとウェスタンブロッティングワークフローが確立されており、PCDプロセスの包括的な特性評価を提供しています。この方法は、発生、恒常性、感染、炎症、および癌の研究分野に適用して、健康と疾患の細胞プロセス全体にわたるPCD経路を評価することができます。

Introduction

自然免疫系は、感染中および組織損傷や恒常性の変化などの無菌刺激に応答して、最初の防御線として機能します。細胞表面と細胞質にある自然免疫センサーは、病原体または損傷に関連する分子パターン(それぞれPAMPまたはDAMP)に応答し、炎症性シグナル伝達経路と細胞応答を引き起こします。自然免疫応答の重要なプロセスの1つは、感染または損傷した細胞を除去し、さらなる自然免疫応答および適応免疫応答を促進するための細胞死の誘導です。プログラム細胞死(PCD)は、種を超えて高度に保存されたプロセスであり、自然免疫メカニズムとしての進化的重要性を強調しています。

すべての細胞タイプで活性化できるいくつかの自然免疫PCD経路があります。カスパーゼは、高度に保存された細胞内システイン依存性プロテアーゼの重要なファミリーであり、従来の非炎症性アポトーシス経路だけでなく、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなどの炎症性PCD経路を含む多くのPCD経路で重要です1,2,3,4,5 .明確に定義された11のヒトカスパーゼと10のマウスカスパーゼ、および機能的である可能性のある疑似カスパーゼがあり、ほとんどは、活性化のために切断を必要とする不活性な単量体または二量体のプロカスパーゼとして構成的に発現されます6,7。カスパーゼには、多タンパク質複合体の動員と形成のための重要なドメインも含まれています。これらには、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-4、カスパーゼ-5、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-11に見られるカスパーゼ活性化およびリクルートメントドメイン(CARD)、またはカスパーゼ-8およびカスパーゼ-10に見られるデスエフェクタードメイン(DED)が含まれます。カスパーゼは、タンパク質分解活性と多タンパク質複合体を形成する能力の両方を通じて、自然免疫PCDの重要な推進力です。

自然免疫PCDにおけるカスパーゼの役割は、開始カスパーゼであるカスパーゼ-2、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、およびカスパーゼ-10が実行者カスパーゼ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-6、およびカスパーゼ-7を活性化して細胞死を引き起こすアポトーシスで最初に確認されました8,9,10,11,12。イニシエーターカスパーゼは、多様なシグナル伝達カスケードによって活性化することができる。外因性経路は細胞外リガンド誘発性死受容体シグナル伝達を介してカスパーゼ-8を活性化し、内因性経路はミトコンドリア完全性の破壊を介してカスパーゼ-9を活性化します13。活性化された開始カスパーゼは、実行者カスパーゼの大小の触媒サブユニットを分離するリンカーを切断して、それらの活性型を生成します。次に、死刑執行者のカスパーゼは基質を切断して細胞を分解し、DNA分解、膜ブレッブ、核断片化、およびアポトーシス体の放出をもたらします14,15。このプロセスは典型的には、エフェロサイトーシスによる死にかけている細胞の即時クリアランスと相まって、非溶解性および非炎症性の細胞死の形態で終わる16。しかし、エフェロサイトーシスの欠陥または食細胞の欠如は、アポトーシス細胞の蓄積につながる可能性があり、その後、溶解性および炎症性細胞死を経験します17,18

カスパーゼ-1(ヒトおよびマウス)、カスパーゼ-4およびカスパーゼ-5(ヒト)、およびカスパーゼ-11(マウス)を含む炎症性カスパーゼは、パイロトーシスと呼ばれる炎症性自然免疫PCD(III-PCD)の形態の間に活性化されることが発見されている。カスパーゼ-1の活性化は、細胞質自然免疫センサー、アダプター分子(CARD[ASC]を含むアポトーシス関連斑点様タンパク質)、およびカスパーゼ-1を含む多タンパク質複合体であるインフラマソームの形成に関連しています。この複合体の形成により、カスパーゼ-1は近接媒介自己タンパク質分解を受けてその活性型を放出し、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン(IL)-1βおよびIL-18、および孔形成分子ガスダーミンD(GSDMD)を含む標的基質を切断することができます19,20,21,22,23。.カスパーゼ-11、カスパーゼ-4、およびカスパーゼ-5は、リポ多糖(LPS)19,20などのPAMPを感知した後、インフラマソームの上流形成なしにGSDMDを活性化することもできます。これらのカスパーゼは、細胞質LPSに結合すると、二量体化とそれに続くオリゴマー化および自己切断を受けて活性化され、非標準的なインフラマソーム活性化24,25,26およびカスパーゼ-1活性化を細胞内因性的に誘導してIL-1βおよびIL-18成熟を誘導する20これらの炎症誘発性サイトカインの成熟と放出は、これらのカスパーゼを「炎症性」として特徴付けます。さらに、アポトーシスカスパーゼ-8はインフラマソームに局在し、アポトーシスプロセスとパイロトーシスプロセスの間のリンクを提供することがわかっています。研究によると、アポトーシスカスパーゼ-8は、ネクロプトーシスと呼ばれる別の形態のPCDを調節するためにも重要であることがわかっています。カスパーゼ-8の喪失は、自発的に受容体相互作用するセリン-スレオニンキナーゼ3(RIPK3)媒介混合系統キナーゼドメイン様シュードキナーゼ(MLKL)活性化をもたらし、ネクロトーシスのIII-PCD経路を駆動します27,28,29,30,31,32,33,34,35。

カスパーゼは歴史的に、カスパーゼが開始する細胞死の種類に基づいて「アポトーシス」または「炎症性」に分類されてきましたが、カスパーゼを介した自然免疫PCD経路の間に広範なクロストークがあることを示唆する証拠が増えています3,4。例えば、インフラマソーム由来の炎症性カスパーゼ−1は、その標準的な活性化部位34でアポトーシスカスパーゼ−7を切断する。カスパーゼ-1の活性化は、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP1)36などのアポトーシス基質の切断にもつながります。GSDMDを欠く細胞では、カスパーゼ-1はカスパーゼ-3を切断することもできる37,38。さらに、標準的にアポトーシスカスパーゼ-3は、ガスデルミンE(GSDME)を切断してPCD17,18を誘導し、GSDMDを不活性型40に処理することもできます。さらに、インフラマソーム複合体へのカスパーゼ-8の動員が観察されており39、40、41、424344、45、およびカスパーゼ-8は標準的および非標準的なインフラマソーム活性化の重要な調節因子である39また、多くの炎症状態においてカスパーゼ-8およびカスパーゼ-1には重複した冗長な役割があり、パイロトーシス、アポトーシス、およびネクロトーシス成分の活性化を特徴とする自然免疫PCDは、疾患スペクトル全体で発生します39、46、47484950

炎症性カスパーゼとアポトーシスカスパーゼのクロストークに基づいて、自然免疫とPCDの機構的理解における重要なギャップが特定され、PANoptosisの発見につながりました。PANoptosisは、病原体、PAMP、DAMP、および恒常性の変化に応答して活性化され、他の細胞死経路からの成分を統合する多面的な高分子複合体であるPANoptosomesによって制御されるIII-PCDのユニークな形態です44,50,51,52,53,54,55.PANoptosisの生物学的効果の全体は、パイロトーシス、アポトーシス、またはネクロトーシスだけでは個別に説明できません3,4,35,36,39,46,47,48、PANoptosisは、カスパーゼ-1、カスパーゼ-11、カスパーゼ-8、カスパーゼ-9、カスパーゼ-3、および/またはカスパーゼ-7を含む複数のカスパーゼの活性化によって特徴付けられるためです。コンテキストに応じて44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 .PANoptosisは、感染症や炎症性疾患、癌やがん治療にますます関与しています3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 5456
57,58,59,60,61,62,63,64,65,66。

アポトーシス、パイロトーシス、ネクロプトーシス、パンノプトーシスなど、細胞死経路全体でカスパーゼが果たす重要な役割を考えると、それらの活性化を特徴付け、PCD経路の完全な複雑さを理解するための技術を開発することが重要です。ここでのプロトコルは、細胞を刺激し、その後のカスパーゼの活性化を測定する方法を詳述しています(図1)。この方法は、カスパーゼの活性化に一般的に必要とされるカスパーゼのタンパク質分解切断を、カスパーゼの研究手段として活用しています。ウェスタンブロッティングにより、タンパク質サイズを決定できるため、不活性なプロカスパーゼとその活性化された切断型を明確に可視化して区別することができます。

このプロトコルの主な利点は、1)内因性細胞の単一集団から複数のカスパーゼの活性化を並行して評価して、PCD活性化をより正確に決定できること、および2)広範なトレーニングや高価な機器を必要としない比較的単純なラボ技術の使用です。これまでのプロトコルでは、ウェスタンブロッティング、蛍光レポーター、または抗体染色を使用して、培養上清、細胞および組織溶解物、全細胞中のカスパーゼ活性化を顕微鏡検査、およびin vivoでモニターしていました6768697071ですが、これらの手法は通常サンプル中の1つまたは2つのカスパーゼのみをモニターします。さらに、切断時に蛍光を発するカスパーゼ切断部位を含む合成ペプチド基質が、細胞または組織ライセート69におけるカスパーゼ活性化をモニターするために使用されてきたが、これらの基質はしばしば複数のカスパーゼによって切断される可能性があり、この系における個々のカスパーゼの特異的活性化を決定することは困難である。さらに、蛍光レポーターや他のタグベースの方法を使用するのではなく、ウェスタンブロッティングを使用することで、研究者はレポーター遺伝子を持つ特定の細胞株を作成するのではなく、内因性細胞を使用することができます。内因性細胞を使用することには、多くの不死化細胞株が重要な細胞死分子72,73が不足しているという事実を含む複数の利点があり、結果に影響を与える可能性があります。さらに、内因性細胞を使用することで、単一の系統ではなく、マクロファージ、上皮細胞、内皮細胞などの多様な細胞タイプの評価が可能になります。ウェスタンブロッティングは比較的シンプルで費用対効果の高い手法でもあり、大型で高価な装置や複雑なセットアップを必要とせずに、世界中のラボで実施できます。

このプロトコルは、カスパーゼの細胞死依存性および細胞死非依存性機能の両方を理解するために、他の炎症性シグナル伝達経路におけるそれらの足場の役割および機能を含む、生物学全体に広く適用可能である74。この方法を適用することで、自然免疫PCD経路と疾患および状態全体の炎症シグナル伝達の研究における統一されたアプローチが可能になり、このプロトコルを使用して、将来の治療戦略の開発に情報を提供する重要な調節プロセスと機構的接続を特定できます。

Protocol

動物の使用と手順は、動物の使用と世話に関するセントジュード小児研究病院委員会によって承認されました。 1.ソリューションの準備 L929 コンディショニングメディアを準備します。プレート1×106 L929細胞(材料の表を参照)を、50mLのL929培養培地(培地の調製については表1を参照)を含む182cm2組織培養フラスコに?…

Representative Results

PANoptosisは、多数の細菌、ウイルス、真菌の感染やその他の炎症性刺激に応答して、ならびに癌細胞で観察されています44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62<sup class…

Discussion

カスパーゼの切断と活性化をモニタリングすることで、自然免疫応答の一部としての自然免疫PCD活性化の最も包括的な画像の1つが得られます。ここに記載のプロトコルは、IAV、HSV1、およびF.ノビシダ感染および滅菌トリガーLPS + ATPに応答してカスパーゼ活性化をモニターする戦略を示すが、多数の他の刺激がPCDを誘導することができ、いくつかの刊行物44、48、49、<su…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

カンネガンティ研究室のメンバーのコメントや提案に感謝し、科学編集のサポートをしてくれたJ.ガレット博士に感謝します。私たちの研究室での作業は、国立衛生研究所(NIH)の助成金AI101935、AI124346、AI160179、AR056296、およびCA253095(T.-D.K.)およびアメリカのレバノンシリア関連慈善団体(T.-D.K.)によってサポートされています。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

Materials

0.45 μm filter Millipore SCHVU05RE
10 mL syringe BD Biosciences 309604
12% polyacrylamide gel with 10 wells  Bio-Rad 4561043
12-well plate  Corning 07-200-82
18 G needle  BD Biosciences 305195
25 G needle  BD Biosciences 305122
50 mL tube  Fisher Scientific 50-809-218
70 μm cell strainer  Corning 431751
150 mm tissue culture dishes Corning 430597
182-cm2 tissue culture flask Genesee Scientific 25-211
Accessory white trans tray Cytiva 29-0834-18
Anti–caspase-1 antibody AdipoGen AG-20B-0042-C100
Anti–caspase-11 antibody Novus Biologicals NB120-10454
Anti–caspase-3 antibody Cell Signaling Technology 9662
Anti–caspase-7 antibody Cell Signaling Technology 9492
Anti–caspase-8 antibody Cell Signaling Technology 4927
Anti–caspase-9 antibody Cell Signaling Technology 9504
Anti–cleaved caspase-3 antibody  Cell Signaling Technology 9661
Anti–cleaved caspase-7 antibody  Cell Signaling Technology 9491
Anti–cleaved caspase-8 antibody  Cell Signaling Technology 8592
Anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 315-035-047
Anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 111-035-047
Anti-rat HRP-conjugated secondary antibody  Jackson ImmunoResearch Laboratories 112-035-003
Anti–β-Actin antibody (C4) HRP Santa Cruz sc-47778 HRP
ATP InvivoGen tlrl-atpl
BBL Trypticase Soy Broth BD Biosciences 211768
Bead bath Chemglass Life Sciences CLS-4598-009
Biophotometer D30 Eppendorf 6133000010
BME Sigma M6250
Bromophenol blue  Sigma BO126
Cell scrapers CellTreat Scientific Products 229315
Chemiluminescence imager (Amersham 600)  Cytiva 29083461
CO2 chamber VetEquip 901703
Cuvettes Fisher Scientific 14-955-129
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 221S
DMEM Thermo Fisher Scientific 11995-073
DTT Sigma 43815
Eelectrophoresis apparatus  Bio-Rad 1658004
Ethanol Pharmco 111000200
Fetal bovine serum  Biowest S1620
Filter paper Bio-Rad 1703965
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Francisella novicida (U112 strain) BEI Resources NR-13
Gel releaser  Bio-Rad 1653320
Gentamycin Gibco 15750060
Glycerol Sigma G7893
Glycine Sigma G8898
HCl Sigma H9892
Heat block Fisher Scientific 23-043-160
Herpes simplex virus 1 (HF strain) ATCC VR-260
High glucose DMEM  Sigma D6171
Human anti–caspase-1 antibody R&D Systems MAB6215
Human anti–caspase-8 antibody Enzo ALX-804-242
Humidified incubator  Thermo Fisher Scientific 51026282
Image analysis software ImageJ v1.53a
IMDM Thermo Fisher Scientific 12440-053
Influenza A virus (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])  constructed per Hoffmann et al.
L929 cells ATCC CCL-1 cell line for creating L929-conditioned media
L-cysteine  Thermo Fisher Scientific BP376-100
Luminata Forte Western HRP substrate Millipore WBLUF0500 standard-sensitivity HRP substrate
MDCK cells ATCC CCL-34 cell line for determining IAV viral titer
Methanol Sigma 322415
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002401
Non-essential amino acids  Gibco 11140050
Nonfat dried milk powder Kroger
NP-40 solution  Sigma 492016
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin and streptomycin  Sigma P4333
Petri dish Fisher Scientific 07-202-011
PhosSTOP Roche PHOSS-RO
Power source  Bio-Rad 164-5052
Protease inhibitor tablet Sigma S8820
PVDF membrane  Millipore IPVH00010
Rocking shaker Labnet S2035-E
SDS Sigma L3771
Sodium chloride  Sigma S9888
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium hydroxide Sigma 72068
Sodium pyruvate  Gibco 11360-070
Square Petri dish Fisher Scientific FB0875711A
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059
Super Signal Femto HRP substrate Thermo Fisher Scientific 34580 high-sensitivity HRP substrate
Tabletop centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004524
Trans-Blot semi-dry system  Bio-Rad 170-3940
Tris Sigma TRIS-RO
Tween 20  Sigma P1379
Ultrapure lipopolysaccharide (LPS) from E. coli 0111:B4 InvivoGen tlrl-3pelps
Vero cells ATCC CCL-81 cell line for determining HSV1 viral titer

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Han, J., Tweedell, R. E., Kanneganti, T. Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death. J. Vis. Exp. (191), e64308, doi:10.3791/64308 (2023).

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