Live-Bildgebung früher kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo
Summary
Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Embryokultur und Bildgebung von Mäusen vor, das eine 3D + Zeit-Bildgebung von kardialen Vorläuferzellen ermöglicht. Dieses Video-Toolkit befasst sich mit den Schlüsselqualifikationen, die für eine erfolgreiche Live-Bildgebung erforderlich sind, die sonst nur schwer von reinen Textpublikationen zu erwerben sind.
Abstract
Die ersten Schritte der Herzentwicklung implizieren drastische Veränderungen im Zellverhalten und in der Zelldifferenzierung. Während die Analyse von fixierten Embryonen es ermöglicht, bestimmte Entwicklungsstadien in einem Standbild im Detail zu untersuchen, erfasst die Live-Bildgebung dynamische morphogenetische Ereignisse wie Zellmigration, Formveränderungen und Differenzierung, indem sie den Embryo während seiner Entwicklung abbildet. Dies ergänzt die fixe Analyse und erweitert das Verständnis dafür, wie sich Organe während der Embryogenese entwickeln. Trotz seiner Vorteile wird die Live-Bildgebung aufgrund ihrer technischen Herausforderungen selten in Mausmodellen eingesetzt. Frühe Mausembryonen sind empfindlich, wenn sie ex vivo kultiviert werden, und erfordern eine effiziente Handhabung. Um eine breitere Nutzung der Live-Bildgebung in der Entwicklungsforschung von Mäusen zu ermöglichen, wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Zwei-Photonen-Live-Mikroskopie vorgestellt, das eine langfristige Erfassung in Mausembryonen ermöglicht. Zusätzlich zum Protokoll werden Tipps zum Umgang mit Embryonen und zur Kulturoptimierung gegeben. Dies wird dazu beitragen, Schlüsselereignisse in der frühen Organogenese von Mäusen zu verstehen und das Verständnis der kardiovaskulären Vorläuferbiologie zu verbessern.
Introduction
Das Herz bildet sich früh während der Embryogenese, um Nährstoffe in den gesamten Embryo zu pumpen, während er sich weiter entwickelt1. Bei Mausembryonen sammelt sich eineinhalb Tage nach Beginn der Gastrulation ein rudimentäres Herzorgan am vorderen Pol 2,3. Im Early Streak (ES)-Stadium dringen kardiale Vorläuferzellen im Epiblasten durch den primitiven Streifen in die entstehende mesodermale Schicht 4,5,6 ein und beginnen zum vorderen Pol zu wandern, wo sie sich differenzieren, um den primitiven Herzschlauch zu bilden. Während dieses Prozesses durchlaufen frühe Herzvorläuferzellen zusätzlich zur Migration Zellumlagerungen, Formtransformationen und Differenzierung7 (Abbildung 1).
Frühe kardiale Vorläuferzellen haben Forscher seit fast einem Jahrhundert aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, ein funktionelles Organ gleichzeitig zu differenzieren und aufzubauen, angezogen. In den letzten zwei Jahrzehnten haben klonale Analysen und bedingte Knockout-Modelle gezeigt, dass die frühe Herzentwicklung unterschiedliche Zellquellen in einen hochdynamischen Prozess einbezieht 8,9,10. Die 3D-Struktur des primitiven Herzschlauchs und die dynamische Natur seiner Morphogenese machen es jedoch schwierig, ihn zu untersuchen (Abbildung 1), und wir sind weit davon entfernt, seine volle Komplexität zu verstehen11.
Um diese dynamischen zellulären Prozesse zu untersuchen, bieten Live-Imaging-Verfahren jetzt eine noch nie dagewesene Detailgenauigkeit 7,12,13,14. Im Mausmodell waren Live-Ansätze der Schlüssel zur Befragung von Entwicklungsthemen, die durch statische Analyse schwer zu beantworten sind 7,13,15. Während langfristige Ex-vivo-Kulturen und robuste Mikroskopaufbauten schnell voranschreiten16,17, verfügen nur wenige Forscher über das Fachwissen, um lebende Embryonen erfolgreich abzubilden. Obwohl papierbasierte Veröffentlichungen genügend technische Details enthalten, um Live-Bildgebungsexperimente zu reproduzieren, sind einige Fähigkeiten und Tricks ohne visuelle Beispiele oder Peer-to-Peer-Unterstützung schwer zu verstehen. Um diesen Lernprozess zu beschleunigen und den Einsatz von Live-Bildgebung in Laboratorien zu verbreiten, haben wir ein Videoprotokoll (Abbildung 2) zusammengestellt, das die notwendigen Fähigkeiten für die Durchführung von Live-Bildgebung an gastulierenden Mausembryonen sammelt.
Abbildung 1: Frühe Differenzierung kardialer Vorläuferzellen im Mausembryo vom Beginn der Gastrulation bis zum Stadium vor der primitiven Herzschlauchbildung. Herzvorläuferzellen dringen kurz nach Beginn der Gastrulation in das Mesoderm ein und wandern auf die gegenüberliegende Seite des Embryos. Das morphologische und das embryonale Tagesstadium (E) werden oben auf den Diagrammen geschrieben. Gestrichelte Pfeile zeigen die Migrationsbahn primitiver Herzröhrenvorläufer während der Gastrulation. Diese Zahl wurde von11 angepasst. Abkürzungen: ES = Early Streak; MS = Mittlerer Streifen; EHF = Frühe Kopffalte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Workflow-Diagramm für die Live-Bildgebung von frühen Herzvorläufern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frühe Herzvorläufer organisieren sich in einem primitiven Herzschlauch, der zu schlagen beginnt, während er sich noch bildet. Zu verstehen, wie dieser Prozess abläuft, ist der Schlüssel, um das breite Spektrum angeborener Herzfehler auf bestimmte morphogenetische Ereignisse zurückzuführen. Dafür bietet die Live-Bildgebung die Möglichkeit, die normale und fehlerhafte Embryonalentwicklung mit erhöhter zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich, um frühe kardiale Vorläuferzellen zu unters…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Kenzo Ivanovitch für seine früheren Arbeiten zu dieser Methode und der Gruppe von Dr. Shigenori Nonaka (National Institutes of Natural Sciences, Japan) für die Bereitstellung der ersten Expertise zur Embryonenmontage. Diese Studie wurde durch den Zuschuss PGC2018-096486-B-I00 des spanischen Ministerio de Ciencia e Innovación und den Zuschuss H2020-MSCA-ITN-2016-722427 aus dem EU-Programm Horizon 2020 für MT und Zuschuss 1380918 aus dem FEDER Andalucía 2014-2020 Operating Program an JND unterstützt. MS wurde durch ein PhD-Stipendium der La Caixa Foundation (LCF/BQ/DE18/11670014) und ein Reisestipendium der Company of Biologists (DEVTF181145) unterstützt. Das CNIC wird vom spanischen Wissenschaftsministerium und der ProCNIC-Stiftung unterstützt.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Referências
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