التصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة في جنين الفأر
Summary
نقدم بروتوكولا مفصلا لزراعة أجنة الفئران والتصوير الذي يتيح تصوير وقت 3D + للخلايا السلفية القلبية. تتناول مجموعة أدوات الفيديو هذه المهارات الأساسية المطلوبة للتصوير المباشر الناجح الذي يصعب اكتسابه من المنشورات النصية فقط.
Abstract
تتضمن الخطوات الأولى لنمو القلب تغييرات جذرية في سلوك الخلية والتمايز. بينما يسمح تحليل الأجنة الثابتة بدراسة مراحل نمو محددة بالتفصيل في لقطة ثابتة ، فإن التصوير الحي يلتقط الأحداث المورفولوجية الديناميكية ، مثل هجرة الخلايا وتغيرات الشكل والتمايز ، عن طريق تصوير الجنين أثناء تطوره. هذا يكمل التحليل الثابت ويوسع فهم كيفية تطور الأعضاء أثناء التطور الجنيني. على الرغم من مزاياه ، نادرا ما يستخدم التصوير المباشر في نماذج الماوس بسبب تحدياته التقنية. تكون أجنة الفئران المبكرة حساسة عند استزراعها خارج الجسم الحي وتتطلب معالجة فعالة. لتسهيل الاستخدام الأوسع للتصوير الحي في أبحاث نمو الفئران ، تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للفحص المجهري الحي ثنائي الفوتون الذي يسمح باكتساب أجنة الفئران على المدى الطويل. بالإضافة إلى البروتوكول ، يتم تقديم نصائح حول التعامل مع الأجنة وتحسين الثقافة. سيساعد هذا في فهم الأحداث الرئيسية في تكوين أعضاء الفئران المبكرة ، مما يعزز فهم بيولوجيا السلف القلبي الوعائي.
Introduction
يتشكل القلب مبكرا أثناء التطور الجنيني لبدء ضخ العناصر الغذائية إلى الجنين بأكمله ، بينما يستمر في النمو1. في أجنة الفئران ، بعد يوم ونصف من بدء المعدة ، يتجمع عضو القلب البدائي في القطب الأمامي 2,3. بحلول مرحلة الخط المبكر (ES) ، يدخل السلف القلبي في epiblast عبر الخط البدائي إلى طبقة الأديم المتوسط الوليدة4،5،6 ويبدأ في الهجرة إلى القطب الأمامي ، حيث يتمايز لتشكيل أنبوب القلب البدائي. خلال هذه العملية ، يخضع أسلاف القلب الأوائل لإعادة ترتيب الخلايا ، وتحولات الشكل ، والتمايز ، بالإضافة إلى الهجرة7 (الشكل 1).
اجتذب أسلاف القلب الأوائل الباحثين لما يقرب من قرن من الزمان بسبب قدرتهم الرائعة على التمييز وبناء عضو وظيفي في وقت واحد. على مدى العقدين الماضيين ، أظهر التحليل النسيلي ونماذج الضربة القاضية الشرطية أن نمو القلب المبكر ينطوي على مصادر خلايا متميزة في عملية ديناميكية للغاية8،9،10. ومع ذلك ، فإن البنية ثلاثية الأبعاد لأنبوب القلب البدائي والطبيعة الديناميكية لتشكله تجعل من الصعب دراسته (الشكل 1) ، ونحن بعيدون عن فهم تعقيده الكامل11.
لدراسة هذه العمليات الخلوية الديناميكية ، تقدم طرق التصوير الحية الآن تفاصيل غير مسبوقة7،12،13،14. في نموذج الماوس ، كانت الأساليب الحية أساسية لاستجواب الموضوعات التنموية التي يصعب معالجتها من خلال التحليل الثابت7،13،15. في حين أن زراعة الجسم الحي على المدى الطويل وإعدادات المجهر القوية تتقدم بسرعة16,17 ، فإن القليل من الباحثين لديهم الخبرة اللازمة لتصوير الأجنة الحية بنجاح. على الرغم من أن المنشورات الورقية توفر تفاصيل فنية كافية لإعادة إنتاج تجارب التصوير الحية ، إلا أنه من الصعب فهم بعض المهارات والحيل بدون أمثلة مرئية أو مساعدة من نظير إلى نظير. لتسريع عملية التعلم هذه ونشر استخدام التصوير الحي بين المختبرات ، قمنا بتجميع بروتوكول فيديو (الشكل 2) يجمع المهارات اللازمة لإجراء التصوير الحي على أجنة الفئران المعدة.
الشكل 1: التمايز المبكر للخلايا السلفية القلبية في جنين الفأر من بداية عملية شد المعدة إلى المرحلة التي تسبق تكوين أنبوب القلب البدائي. تدخل الخلايا السلفية القلبية الأديم المتوسط بعد وقت قصير من بدء المعدة ، وتهاجر إلى الجانب الآخر من الجنين. تتم كتابة مرحلة اليوم المورفولوجي والجنيني (E) أعلى المخططات. تصور الأسهم المتقطعة مسار هجرة أسلاف أنبوب القلب البدائي أثناء المعدة. تم تكييف هذا الرقم من11. الاختصارات: ES = الخط المبكر ؛ MS = الخط الأوسط ؛ EHF = طية الرأس المبكرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط سير العمل للتصوير الحي لأسلاف القلب المبكرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Protocol
Representative Results
Discussion
ينتظم أسلاف القلب الأوائل في أنبوب قلب بدائي يبدأ في النبض بينما لا يزال يتشكل. يعد فهم كيفية حدوث هذه العملية أمرا أساسيا لتحديد مجموعة واسعة من عيوب القلب الخلقية لأحداث مورفوجينية محددة. لذلك ، يوفر التصوير الحي فرصة لدراسة التطور الجنيني الطبيعي والمعيب مع زيادة الدقة الزمنية. هذا مفي…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بالدكتور كينزو إيفانوفيتش لعمله السابق على هذه الطريقة ومجموعة الدكتور شيجينوري نوناكا (المعاهد الوطنية للعلوم الطبيعية ، اليابان) لتوفير الخبرة الأولية في تركيب الأجنة. تم دعم هذه الدراسة من قبل Grant PGC2018-096486-B-I00 من وزارة العلوم والابتكار الإسبانية و Grant H2020-MSCA-ITN-2016-722427 من برنامج EU Horizon 2020 إلى MT و Grant 1380918 من برنامج التشغيل FEDER Andalucía 2014-2020 إلى JND. تم دعم MS من خلال زمالة الدكتوراه في مؤسسة La Caixa (LCF / BQ / DE18 / 11670014) وزمالة سفر شركة علماء الأحياء (DEVTF181145). يتم دعم CNIC من قبل وزارة العلوم الإسبانية ومؤسسة ProCNIC.
Materials
| #55 Forceps | Dumont | 11295-51 | |
| 35 mm Dish with glass coverslip bottom 14 mm Diameter | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| 35 mm vise table | Grandado | SKU 8798771617573 | |
| 50 mL tubes | BD Falcon | 352070 | |
| Distilled water | |||
| DMEM – Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11966025 | with L-Glutamine, without Glucose, without Na Pyruvate |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 10438-026 | |
| Fluorescent reporter transgenic mice (Tg(CBF:H2BVenus,+) | JAX | ||
| Fluorobrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM for live-cell imaging |
| High-vacuum silicone grease | Dow Corning | Z273554-1EA | |
| Holder for wires | Perlen Pressen | pwb1 | |
| LSM 780 Upright microscope | Zeiss | ||
| MaiTai Deepsee far red pulsed-laser tuned at 980 nm | Spectra-Physics | ||
| Non Descanned Detectors equipped with the filter sets cyan-yellow (BP450-500/BP520-560), green-red (BP500-520/BP570-610) and yellow-red (BP520-560/BP645-710) |
Zeiss | ||
| Obj: 20x water dipping 1.0 NA, long working distance | Zeiss | ||
| P1000 and P200 pipettes | |||
| Paraffin Oil | Nidacon | VNI0049 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | (the final concentration should be 50 μg/mL penicillin and 50 μg/mL streptomycin) |
| Petri dishes 35 mm x 10 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Pipette tips | |||
| Polymethyl methacrylate | Reused from old laboratory equipment | ||
| Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD | Janvier Labs | 9979 | |
| Set of 160 mm fines | RS PRO | 541-6933 | |
| Standard 1.0 mm glass capillaries | Anima Lab | 1B100F-3 | |
| Sterile 0.22 μm syringe filter | Corning | 431218 | |
| Sterile 5 mL syringe | Fisher Scientific | 15809152 | |
| Tungsten needles | |||
| Ultrasonic homogeniser (sonicator) | Bandelin | BASO_17021 |
Referências
- Tyser, R. C. V., et al. Calcium handling precedes cardiac differentiation to initiate the first heartbeat. eLife. 5, 17113 (2016).
- Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. Heart fields and cardiac morphogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).
- Evans, S. M., Yelon, D., Conlon, F. L., Kirby, M. L. Myocardial lineage development. Circulation Research. 107 (12), 1428-1444 (2010).
- Tam, P. P., Parameswaran, M., Kinder, S. J., Weinberger, R. P. The allocation of epiblast cells to the embryonic heart and other mesodermal lineages: the role of ingression and tissue movement during gastrulation. Development. 124 (9), 1631-1642 (1997).
- Kinder, S. J., Loebel, D. A. F., Tam, P. P. L. Allocation and early differentiation of cardiovascular progenitors in the mouse embryo. Trends in Cardiovascular Medicine. 11 (5), 177-184 (2001).
- Lawson, K. A. Fate mapping the mouse embryo. International Journal of Developmental Biology. 43 (7), 773-775 (1999).
- Ivanovitch, K., Temiño, S., Torres, M. Live imaging of heart tube development in mouse reveals alternating phases of cardiac differentiation and morphogenesis. eLife. 6, 30668 (2017).
- Meilhac, S. M., Buckingham, M. E. The deployment of cell lineages that form the mammalian heart. Nature Reviews Cardiology. 15 (11), 705-724 (2018).
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).
- Meilhac, S. M., Lescroart, F., Blanpain, C. D., Buckingham, M. E. Cardiac cell lineages that form the heart. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (9), 013888 (2014).
- Sendra, M., Domínguez, J. N., Torres, M., Ocaña, O. H. Dissecting the complexity of early heart progenitor cells. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 9 (1), 5 (2022).
- McDole, K., et al. In toto imaging and reconstruction of post-implantation mouse development at the single-cell level. Cell. 175 (3), 859-876 (2018).
- Saykali, B., et al. Distinct mesoderm migration phenotypes in extra-embryonic and embryonic regions of the early mouse embryo. eLife. 8, 42434 (2019).
- Ichikawa, T., et al. Live imaging of whole mouse embryos during gastrulation: Migration analyses of epiblast and mesodermal cells. PLoS ONE. 8 (7), 64506 (2013).
- Tyser, R. C. V., et al. Single-cell transcriptomic characterization of a gastrulating human embryo. Nature. 600 (7888), 285-289 (2021).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Yue, Y., et al. in toto live imaging of cardiomyocyte behaviour during mouse ventricle chamber formation at single-cell resolution. Nature Cell Biology. 22 (3), 332-340 (2020).
- Nowotschin, S., Xenopoulos, P., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K. A bright single-cell resolution live imaging reporter of Notch signaling in the mouse. BMC Developmental Biology. 13 (1), 15 (2013).
- Cold Spring Harbor Protocols. Sharpened tungsten needles. Cold Spring Harbor Protocols. , (2012).
- Tam, P. P., Snow, M. H. The in vitro culture of primitive-streak-stage mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 59, 131-143 (1980).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Preparation of rat serum for culturing mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5593 (2011).
- Tam, P. P. L. Postimplantation mouse development: Whole embryo culture and micro- manipulation. International Journal of Developmental Biology. 42 (7), 895-902 (1998).
- Optimización de propiedades fisicoquímicas y medios de cultivo para el cultivo del embrión de ratón ex vivo. Universidad de Jaén. Biología Experimental Available from: https://hdl.handle.net/10953.1/1400 (2021)
- Behringer, R., Gertsenstein, M., Vintersen Nagy, K., Nagy, A. . Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual, Fourth Edition. , 814 (2014).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), e160 (2006).
- Nonaka, S. Modification of mouse nodal flow by applying artificial flow. Methods in Cell Biology. 91, 287-297 (2009).
- Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Time-lapse imaging of postimplantation mouse embryos. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (4), 5595 (2011).
- Crainiciuc, G., et al. Behavioural immune landscapes of inflammation. Nature. 601 (7893), 415-421 (2022).
