JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Burada, tek moleküllü toplam iç yansıma floresan (smTIRF) mikroskobu kullanılarak yapay kalabalık lipit membranları üzerindeki tek moleküllerin bağlanma, hareketlilik ve montajını gerçekleştirmek ve analiz etmek için bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Hücresel membranlar, biyomoleküler reaksiyonlar ve sinyalizasyon için oldukça kalabalık ortamlardır. Bununla birlikte, lipitlerle protein etkileşimini araştıran çoğu in vitro deney, çıplak çift katmanlı membranlar kullanır. Bu tür sistemler, membrana gömülü proteinler ve glikanlar tarafından kalabalıklaşmanın karmaşıklığından yoksundur ve hücresel membran yüzeylerinde karşılaşılan ilişkili hacim etkilerini dışlar. Ayrıca, lipit çift katmanlarının oluştuğu negatif yüklü cam yüzey, transmembran biyomoleküllerinin serbest difüzyonunu önler. Burada, kalabalık lipid membranları için bir mimik olarak iyi karakterize edilmiş bir polimer-lipid membranı sunuyoruz. Bu protokol, polietilen glikol (PEG) konjuge lipitleri, crowder’ları desteklenen lipit çift katmanına (SLB) dahil etmek için genelleştirilmiş bir yaklaşım olarak kullanır. İlk olarak, tek moleküllü deneyler yapmak için mikroskobik slaytların ve örtülerin temizleme prosedürü sunulmuştur. Daha sonra, PEG-SLB’leri karakterize etme ve tek moleküllü izleme ve fotobeyazlatma kullanarak biyomoleküllerin bağlanması, difüzyonu ve montajının tek moleküllü deneylerini gerçekleştirme yöntemleri tartışılmaktadır. Son olarak, bu protokol, tek moleküllü fotobeyazlatma analizi ile kalabalık lipit membranları üzerinde bakteriyel gözenek oluşturan toksin Sitolisin A’nın (ClyA) nanopore montajının nasıl izleneceğini göstermektedir. Örnek veri kümelerine sahip MATLAB kodları, parçacık izleme, difüzyon davranışını ayıklama ve alt birim sayımı gibi bazı yaygın analizleri gerçekleştirmek için de dahil edilmiştir.

Introduction

Hücresel membranlar oldukça kalabalık ve karmaşık sistemlerdir1. Moleküler kalabalıklaşma, protein ve lipitler gibi membrana bağlı varlıkların difüzyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir 2,3,4. Benzer şekilde, reseptör dimerizasyonu veya membran komplekslerinin oligomerizasyonu gibi lipit membranlar üzerindeki bimoleküler reaksiyonlar 5,6,7 kalabalığından etkilenir. Kalabalıkların doğası, konfigürasyonu ve konsantrasyonu, membran bağlanmasını, difüzyonunu ve protein-protein etkileşimini çeşitli şekillerde yönetebilir 8,9. Hücresel membranlar üzerindeki membran kalabalığını kontrol etmek ve gömülü biyomoleküller üzerindeki etkisini yorumlamak zor olduğundan, araştırmacılar alternatif in vitro sistemler kurmaya çalışmışlardır10.

Yapay kalabalık membranlar için popüler bir yaklaşım, çift katmanlı membranların polimer (polietilen glikol, PEG gibi) aşılanmış lipitlerle dopinglenmesidir11,12. Desteklenen lipit çift katmanları (SLB’ler) üzerindeki protein ve lipit dinamiklerinin görselleştirilmesi sırasında, bu polimerler ayrıca membrana gömülü bileşenleri, çift katmanı altta yatan destekten etkili bir şekilde kaldırarak altta yatan negatif yüklü substrattan (cam gibi) korur. Polimerin boyutunu ve konsantrasyonunu değiştirerek, moleküler kalabalıklaşmanın derecesini ve altta yatan katı destekten ayrılmasını kontrol edebilir13,14. Bu, polimer yastıkları olmayan katı substratlar üzerinde desteklenen lipit çift katmanlıtabakalara göre açıkça bir avantajdır 15,16, transmembran biyomolekülleri aktivitelerini kaybedebilir17,18,19. Daha da önemlisi, birçok membran işlemi için kritik olan hücre zarının kalabalık ortamını in vitro olarak özetlememizi sağlar.

Membranlar üzerindeki yüzey aşılı polimerler de aşılama yoğunluklarına bağlı olarak konfigürasyonlarında değişikliklere uğrar12. Düşük konsantrasyonlarda, membran yüzeyinin üzerinde, mantar olarak bilinen entropik olarak sarılmış bir konfigürasyonda kalırlar. Artan konsantrasyonla, etkileşime girmeye başlarlar ve açılma ve genişleme eğilimindedirler, sonunda membran21 üzerinde yoğun bir fırça benzeri oluşum sağlarlar. Mantardan fırça rejimine geçiş oldukça heterojen olduğundan ve polimerin kötü karakterize edilmiş koşullarında ortaya çıktığından, polimer aşılı membranlarda kalabalıklaşma için iyi karakterize edilmiş koşulların kullanılması önemlidir. Yakın tarihli bir çalışma20 ile karşılaştırıldığında, transmembran biyomoleküllerinin difüzif taşınımını ve aktivitesini koruyan kalabalık membran bileşimlerini tanımlamakta ve raporlamaktayız.

Bu protokolde, PEGile lipid membranlarının nasıl üretileceğini tartışıyoruz ve iki farklı polimer konfigürasyon rejiminde (yani, mantar ve fırça) kalabalığı taklit eden PEG yoğunlukları için önerilerde bulunuyoruz. Protokol ayrıca bu kalabalık membranlara gömülü moleküller için tek moleküllü bağlanma, parçacık izleme ve fotobeyazlatma veri toplama ve analizini de açıklar. İlk olarak, kapsamlı temizleme adımlarını, görüntüleme odasının montajını ve PEG-SLB’lerin oluşumunu açıklıyoruz. İkincisi, tek moleküllü bağlama, parçacık izleme ve fotobeyazlatma deneyleri için ayrıntılar sağlıyoruz. Üçüncüsü, i) nispi bağlanma afinitelerinin çıkarılmasını, ii) moleküler difüzyonun karakterize edilmesini ve iii) membran üzerindeki tek moleküllerin filmlerinden bir protein grubundaki alt birimlerin sayılmasını tartışıyoruz.

Bu sistemi tek moleküllü görüntüleme ile karakterize etmemize rağmen, protokol, kalabalıklaşmanın lipit membranları üzerindeki biyomoleküler reaksiyonlar üzerindeki etkisini anlamak isteyen tüm membran biyofizikçileri için yararlıdır. Genel olarak, kalabalık ve desteklenen lipit çift katmanları yapmak için sağlam bir boru hattı, bunlar üzerinde yürütülen çeşitli tek moleküllü testler ve ilgili analiz rutinleri sunuyoruz.

Protocol

1. Tek moleküllü deneyler için sürgü ve kapak kaymasının temizlenmesi Görüntüleme odasının montajından önce, hem kapak kapaklarını hem de slaytları temizleyin ve hazırlayın. Elmas kaplı matkap uçlarına (0,5-1 mm çapında) sahip bir delme makinesi kullanarak cam kızaklar üzerinde birden fazla delik çifti açın. Akrilik levhalar kullanılıyorsa, Şekil 1’de gösterildiği gibi hassas delikler (0,5 mm) yapmak için bir lazer kesici kullanı…

Representative Results

ClyA proteininin PEGile membranlara bağlanmasının izlenmesiAdım 4.5’ten sonra, bağlanma kinetiği, zaman içinde membran yüzeyine bağlanan parçacıkların sayısını çizerek tahmin edilir (Video 1). ClyA proteini% 5 mol% PEG2000 lipitli bir zara bağlandığında, parçacık yoğunluğu artar ve doygunluğa ulaşır (Şekil 5). Bağlı parçacıklara (camgöbeği daireleri) uyan üstel bir bozunum, membran bağlanması için zaman sabitini (τ<…

Discussion

Burada, membrana gömülü biyomoleküller için kalabalık bir ortam ortaya koyan desteklenen lipit çift katmanları (SLB’ler) üzerinde tek moleküllü deneyler gösteriyoruz. Kalabalık ortam, dışlanmış bir hacim etkisi yaratır ve biyomoleküler reaksiyonlarınartmasına yol açar 1,2,39,40. Polimerin öncelikle çift katmanın dışındaki hacmi kapladığı PEG-lipid sistemi için, b…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, ClyA proteini için plazmid ekspresyonunu paylaştığı için Prof. Benjamin Schuler’e teşekkür ediyor. Bu çalışma Human Frontier Science Program (RGP0047-2020) tarafından desteklenmiştir.

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers – A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly – Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Single-molecule ImagingPolymer-crowded Lipid MembranesSupported Lipid BilayersMembrane Biomolecular ReactionsDiffusionAssemblyPOPCDOPE-PEG(2000)Small Unilamellar VesiclesSonicationMicrofluidic Imaging Chambers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image