Summary

Organotypische culturen van volwassen menselijke cortex als een ex vivo model voor menselijke stamceltransplantatie en validatie

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft organotypische culturen op lange termijn van de volwassen menselijke cortex in combinatie met ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopers, die een nieuwe methodologie presenteren om op stamcellen gebaseerde therapieën voor menselijke neurodegeneratieve aandoeningen verder te testen.

Abstract

Neurodegeneratieve aandoeningen komen vaak voor en zijn heterogeen in termen van hun symptomen en cellulaire affectatie, waardoor hun studie gecompliceerd is vanwege het ontbreken van goede diermodellen die menselijke ziekten volledig nabootsen en de slechte beschikbaarheid van post-mortem menselijk hersenweefsel. Volwassen menselijke zenuwweefselkweek biedt de mogelijkheid om verschillende aspecten van neurologische aandoeningen te bestuderen. Moleculaire, cellulaire en biochemische mechanismen kunnen gemakkelijk worden aangepakt in dit systeem, evenals het testen en valideren van geneesmiddelen of verschillende behandelingen, zoals celgebaseerde therapieën. Deze methode combineert langdurige organotypische culturen van de volwassen menselijke cortex, verkregen van epileptische patiënten die resectieve chirurgie ondergaan, en ex vivo intracorticale transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide corticale voorlopercellen. Deze methode zal de studie van celoverleving, neuronale differentiatie, de vorming van synaptische inputs en outputs en de elektrofysiologische eigenschappen van van de mens afgeleide cellen na transplantatie in intact volwassen menselijk corticale weefsel mogelijk maken. Deze aanpak is een belangrijke stap voorafgaand aan de ontwikkeling van een 3D-platform voor het modelleren van menselijke ziekten dat fundamenteel onderzoek dichter bij de klinische vertaling van op stamcellen gebaseerde therapieën voor patiënten met verschillende neurologische aandoeningen zal brengen en de ontwikkeling van nieuwe hulpmiddelen voor het reconstrueren van beschadigde neurale circuits mogelijk zal maken.

Introduction

Neurodegeneratieve aandoeningen, zoals de ziekte van Parkinson, de ziekte van Alzheimer of ischemische beroerte, zijn een groep ziekten die het gemeenschappelijke kenmerk van neuronale storing of dood delen. Ze zijn heterogeen in termen van het hersengebied en de neuronale populatie die wordt beïnvloed. Helaas zijn behandelingen voor deze ziekten schaars of van beperkte werkzaamheid vanwege het ontbreken van diermodellen die nabootsen wat er in het menselijk brein gebeurt 1,2. Stamceltherapie is een van de meest veelbelovende strategieën voor hersenregeneratie3. De generatie van neuronale voorlopers uit stamcellen uit verschillende bronnen is de afgelopen jaren sterk ontwikkeld 4,5. Recente publicaties hebben aangetoond dat door de mens geïnduceerde pluripotente stam (iPS) cel-afgeleide lange termijn zelfvernieuwende neuro-epitheliale-achtige stam (lt-NES) cellen, volgens een corticale differentiatieprotocol en na intracorticale transplantatie in een ratmodel met ischemische beroerte die de somatosensorische cortex beïnvloedt, volwassen corticale neuronen genereren. Bovendien ontvingen de van graft afgeleide neuronen afferente en efferente synaptische verbindingen van de gastheerneuronen, wat hun integratie in het neuronale netwerk van de rataantoont 6,7. De van het transplantaat afgeleide axonen werden gemyeliniseerd en gevonden in verschillende gebieden van het rattenbrein, waaronder het peri-infarctgebied, corpus callosum en contralaterale somatosensorische cortex. Het belangrijkste is dat iPS-celtransplantatie motorische tekorten bij beroertedieren omkeerde7.

Zelfs als diermodellen helpen bij het bestuderen van transplantatieoverleving, neuronale integratie en het effect van de getransplanteerde cellen op motorische en cognitieve functies, ontbreekt informatie over interactie tussen menselijke cellen (graft-host) in dit systeem 8,9. Om deze reden wordt hier een gecombineerde methode van langdurige organotypische cultuur van de menselijke hersenen met de ex vivo transplantatie van van menselijke iPS-cellen afgeleide neuronale voorlopers beschreven. Organotypische culturen van het menselijk brein verkregen uit neurochirurgische resecties zijn fysiologisch relevante 3D-modellen van de hersenen waarmee onderzoekers hun begrip van de menselijke circuits van het centrale zenuwstelsel en de meest nauwkeurige manier om behandelingen voor menselijke hersenaandoeningen te testen, kunnen vergroten. Er is echter niet genoeg onderzoek gedaan in deze context en in de meeste gevallen zijn menselijke hippocampale hersenorganotypische culturen gebruikt10,11. De hersenschors wordt beïnvloed door verschillende neurodegeneratieve aandoeningen, zoals ischemische beroerte12 of de ziekte van Alzheimer13, dus het is belangrijk om een menselijk corticale 3D-systeem te hebben waarmee we onze kennis kunnen uitbreiden en verschillende therapeutische strategieën kunnen testen en valideren. Verschillende studies in de afgelopen jaren hebben culturen van volwassen humaan corticale (hACtx) weefsel gebruikt om menselijke hersenziekten te modelleren 14,15,16,17,18,19; Er is echter beperkte informatie beschikbaar in het kader van stamceltherapie. Twee studies hebben de haalbaarheid van het hier beschreven systeem al aangetoond. In 2018 werd aangetoond dat menselijke embryonale stamcellen geprogrammeerd met verschillende transcriptiefactoren en getransplanteerd in hACtx-weefsel aanleiding gaven tot volwassen corticale neuronen die konden integreren in volwassen menselijke corticale netwerken20. In 2020 onthulde de transplantatie van lt-NES-cellen in het menselijke organotypische systeem hun vermogen om te differentiëren in volwassen, laagspecifieke corticale neuronen met de elektrofysiologische eigenschappen van functionele neuronen. De geënte neuronen legden zowel afferente als efferente synaptische contacten met de menselijke corticale neuronen in de volwassen hersenplakken, zoals bevestigd door retrograde monosynaptische tracering van het rabiësvirus, patchklemregistraties van hele cellen en immuno-elektronenmicroscopie21.

Protocol

Dit protocol volgt de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de regionale ethische commissie, Lund, Zweden (ethisch vergunningsnummer 2021-07006-01). Gezond neocorticale weefsel werd verkregen van patiënten die electieve chirurgie ondergingen voor temporale kwab epilepsie. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten. OPMERKING: Alle verkregen weefsels werden verwerkt, ongeacht hun grootte. Weefsels kleiner dan 1-1,5 mm3 groot zullen echter technisch uitdagend zijn …

Representative Results

Volgens het beschreven protocol werd hACtx-weefsel van een patiënt met temporale kwab epilepsie verzameld en verwerkt, zoals hierboven uitgelegd. Een paar plakjes werden na 24 uur in cultuur gefixeerd om het startpunt van het gastheerweefsel te bestuderen. De analyse van verschillende neurale celpopulaties zoals neuronen (die NeuN en Map2 tot expressie brengen, figuur 1A), oligodendrocyten (Olig2 en MBP, figuur 1B) en astrocyten (mensspecifiek GFAP, ook wel STEM123 genoemd, figuur 1C) <stro…

Discussion

Het verkrijgen van hACtx-plakjes van voldoende hoge kwaliteit is de meest kritieke stap in dit protocol. Corticaal weefsel wordt verkregen van epileptische patiënten die een resectieve operatie ondergaan24. De kwaliteit van het gereseceerde weefsel, evenals de blootstellingstijd van het weefsel tussen resectie en kweek, is van cruciaal belang; Hoe sneller het weefsel van de operatiekamer naar het laboratorium wordt overgebracht en gesneden, hoe optimaler de organotypische cultuu…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Swedish Research Council, de Swedish Brain Foundation, de Swedish Stroke Foundation, Region Skåne, The Thorsten and Elsa Segerfalk Foundation en het Swedish Government Initiative for Strategic Research Areas (StemTherapy).

Materials

Tissue Cutting and electrophysiology
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt Sigma A9187
Bath temperature controller  Luigs & Neumann TC0511354
Calcium Chloride dihydrate Merck 102382
Carbogen gas Air Liquide NA
Cooler Julaba FL 300 9661012.03
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
Double Patch-Clamp amplifier HEKA electronic EPC10
Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt Millipore 371701
HEPES AppliChem A1069
Magnesium Chloride hexahydrate Sigma-Aldrich M2670
Magnesium Sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391
Patchmaster HEKA electronic Patchmaster 2×91
Pipette Puller Sutter P-2000
Plastic Petri dish Any suitable
Potassium chloride Merck 104936
Potassium D-gluconate ThermoFisher B25135
Rubber teat + glass pipette Any suitable
Sodium Bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium Chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate Merck 106346
Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Tissue adhesive: Acryl super glue Loctite 2062278
Upright microscope Olympus BX51WI 
Vibratome  Leica VT1200 S
RINSING SOLUTION
D-(+)Glucose Sigma-Aldrich G7021
HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) ThermoFisher Scientific 14175095
HEPES AppliChem A1069
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15-140-122
MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE
6-well plate ThermoFisher Scientific 140675
Alvetex scaffold 6 well insert Reinnervate Ltd AVP004-96
B27 Supplement (50x) ThermoFisher Scientific 17504001
BrainPhys without Phenol Red StemCell technologies #05791 Referenced as neuronal medium in the text
Filter units 250 mL or 500 mL Corning Sigma CLS431096/97
Forceps Any suitable
Gentamicin (50 mg/mL) ThermoFisher Scientific 15750037
Glutamax Supplement (100x) ThermoFisher Scientific 35050061 Referenced as L-glutamine in the text
Rubber teat + Glass pipette Any suitable
GENERATION OF lt-NES cells
2-Mercaptoethanol 50 mM ThermoFisher Scientific 31350010
Animal Free Recombinant EGF Peprotech AF-100-15
B27 Suplemment (50x) Thermo Fisher Scientific 17504001
bFGF Peprotech AF-100-18B
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) ThermoFisher Scientific 15260037
Cyclopamine, V. calcifornicum Calbiochem # 239803
D (+) Glucose solution (45%) Sigma G8769
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma Aldrich D2438-10mL
DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320074
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) Thermo Fisher Scientific 14190-144 Without calcium and magnesium
Laminin Mouse Protein, Natural Thermo Fisher Scientific 23017015
MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) ThermoFisher Scientific 11140050
N-2 Supplement (100 x) ThermoFisher Scientific 17502001
Poly-L-Ornithine Merk P3655
Recombinant Human BMP-4 Protein R&D Systems 314-BP-010
Recombinant Human Wnt-3a Protein R&D Systems 5036-WN
Sodium Pyruvate (100 mM) ThermoFisher Scientific 11360070
Soybean Trypsin Inhibitor, powder Thermo Fisher Scientific 17075029
Sterile deionized water MilliQ MilliQ filter system
Trypsin EDTA (0.25%) Sigma T4049-500ML
EQUIPMENT FOR CELL CULTURE 
Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL Eppendorf Various
Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) Corning CLS354277-1EA
Centrifuge Hettich Centrifugen Rotina 420R 5% CO2, 37 °C
Incubator ThermoForma Steri-Cult CO2 HEPA Class100
Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm Vitrolife 14601
Sterile tubes Sarstedt Various
Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm VWR 612-1701
Sterile pipette tips 0.1-1000  µL Biotix VWR Various
Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL Costar Various
T25 flasks Nunc ThermoFisher Scientific 156367
IMMUNOHISTOCHEMISTRY
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-545-151
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG Jackson ImmunoReserach 711-545-152
488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-545-155
Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin Jackson ImmunoReserach 016-600-084
Bovine Serum Albumin Jackson ImmunoReserach 001-000-162
Chicken anti-GFP Merk Millipore AB16901
Chicken anti-MAP2  Abcam ab5392
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG Jackson ImmunoReserach 703-165-155
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG Jackson ImmunoReserach 705-165-147
Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG Jackson ImmunoReserach 715-165-151
Diazabicyclooctane (DABCO) Sigma Aldrich D27802 Mounting media
Goat anti-AIF1 (C-terminal)  Biorad AHP2024
Hoechst 33342 Molecular Probes Nuclear staining
Mouse anti-MBP  BioLegend 808402
Mouse anti-SC123  Stem Cells Inc AB-123-U-050
Normal Donkey Serum Merk Millipore S30-100
Paint brush Any suitable
Paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich 150127
Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x)
     Distilled water
     Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) Merk Millipore 104873
     Potassium phospate dibasic (K2HPO4) Sigma Aldrich P3786
     Sodium chloride (NaCl) Sigma Aldrich S3014
Rabbit anti-NeuN  Abcam ab104225
Rabbit anti-Olig2  Abcam ab109186
Rabbit anti-TMEM119  Abcam ab185333
Sodium azide Sigma Aldrich S2002-5G
Sodium citrate
       Distilled water
       Tri-Sodium Citrate Sigma Aldrich S1804-500G
       Tween-20 Sigma Aldrich P1379
Triton X-100 ThermoFisher Scientific 327371000 
EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY
Confocal microscope Zeiss LSM 780
Microscope Slides 76 mm x 26 mm VWR 630-1985
Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm Marienfeld 107242
Microscope Software Zeiss ZEN Black edition
Rubber teat + Glass pipette Any suitable

Referências

  1. Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
  2. Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
  3. Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
  4. Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
  5. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
  6. Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
  7. Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
  8. Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
  9. Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
  10. Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
  11. Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
  12. Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
  13. Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
  14. Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
  15. Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer’s disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
  16. Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
  17. Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
  18. Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
  19. Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
  20. Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
  21. Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
  22. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
  23. Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
  24. Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
  25. Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
  26. Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
  27. Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
  28. Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
  29. Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
  30. Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
  31. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  32. Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
  33. Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
  34. Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).

Play Video

Citar este artigo
Palma-Tortosa, S., Martínez-Curiel, R., Aretio-Medina, C., Avaliani, N., Kokaia, Z. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (190), e64234, doi:10.3791/64234 (2022).

View Video