תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.
Abstract
הפרעות נוירודגנרטיביות נפוצות והטרוגניות מבחינת הסימפטומים שלהן וההשפעה התאית, מה שהופך את המחקר שלהם למסובך בשל היעדר מודלים נכונים של בעלי חיים המחקים באופן מלא מחלות אנושיות והזמינות הירודה של רקמת המוח האנושית לאחר המוות. תרבית רקמת העצבים האנושית למבוגרים מציעה את האפשרות לחקור היבטים שונים של הפרעות נוירולוגיות. מנגנונים מולקולריים, תאיים וביוכימיים יכולים להיות מטופלים בקלות במערכת זו, כמו גם בדיקה ותיקוף של תרופות או טיפולים שונים, כגון טיפולים מבוססי תאים. שיטה זו משלבת תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת, המתקבלות מחולי אפילפסיה שעברו ניתוח כריתה, והשתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קליפת המוח המושרים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע. שיטה זו תאפשר לחקור את הישרדות התא, התמיינות עצבית, היווצרות קלטים ויציאות סינפטיים, ואת התכונות האלקטרופיזיולוגיות של תאים שמקורם בבני אדם לאחר השתלה ברקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת השלמה. גישה זו היא צעד חשוב לפני פיתוח פלטפורמה תלת-ממדית למידול מחלות אנושיות שתקרב את המחקר הבסיסי לתרגום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע לחולים עם הפרעות נוירולוגיות שונות ותאפשר פיתוח כלים חדשים לשחזור מעגלים עצביים פגועים.
Introduction
הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר או שבץ איסכמי, הן קבוצה של מחלות החולקות את התכונה המשותפת של תפקוד עצבי או מוות. הם הטרוגניים במונחים של אזור המוח והאוכלוסייה העצבית מושפעת. למרבה הצער, טיפולים למחלות אלה הם נדירים או בעלי יעילות מוגבלת בשל היעדר מודלים של בעלי חיים המחקים את מה שקורה במוח האנושי 1,2. טיפול בתאי גזע הוא אחת האסטרטגיות המבטיחות ביותר להתחדשות המוח3. הדור של אבות עצביים מתאי גזע ממקורות שונים התפתח מאוד בשנים האחרונות 4,5. פרסומים אחרונים הראו כי תאי גזע דמויי נוירואפיתל (lt-NES) המושרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע ארוכי טווח המתחדשים מעצמם, בעקבות פרוטוקול התמיינות קליפת המוח ולאחר השתלה תוך-קורטיקלית במודל חולדה עם שבץ איסכמי המשפיע על קליפת המוח הסומטוסנסורית, מייצרים נוירונים בוגרים בקליפת המוח. בנוסף, תאי העצב שמקורם בשתלים קיבלו קשרים סינפטיים afferent ו-efferent מהנוירונים המארחים, והראו את השתלבותם ברשת העצבית של החולדה 6,7. האקסונים שמקורם בשתלים עברו מיאלינציה ונמצאו באזורים שונים במוח החולדה, כולל אזור הפרי-אוטם, כפיס המוח וקליפת המוח הסומטוסנסורית. והכי חשוב, השתלת תאי iPS הפכה ליקויים מוטוריים בחיות שבץ7.
גם אם מודלים של בעלי חיים עוזרים לחקור הישרדות השתלות, אינטגרציה עצבית והשפעת התאים המושתלים על תפקודים מוטוריים וקוגניטיביים, מידע על אינטראקציה בין תאים אנושיים (שתל-מארח) חסר במערכת זו 8,9. מסיבה זו, מתוארת כאן שיטה משולבת של תרבית אורגנוטיפית ארוכת טווח במוח האנושי עם השתלת ex vivo של אבות עצביים אנושיים שמקורם בתאי iPS. תרביות אורגנוטיפיות של המוח האנושי המתקבלות מכריתות נוירוכירורגיות הן מודלים תלת-ממדיים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של המוח, המאפשרים לחוקרים להגביר את הבנתם את המעגלים החשמליים של מערכת העצבים המרכזית האנושית ואת הדרך המדויקת ביותר לבחון טיפולים להפרעות במוח האנושי. עם זאת, לא נעשה מספיק מחקר בהקשר זה, וברוב המקרים, תרביות אורגנוטיפיות של מוח ההיפוקמפוס האנושי שימשו10,11. קליפת המוח מושפעת ממספר הפרעות נוירודגנרטיביות, כגון שבץ איסכמי12 או מחלת אלצהיימר13, ולכן חשוב שתהיה לנו מערכת תלת ממדית קליפת המוח האנושית המאפשרת לנו להרחיב את הידע שלנו ולבדוק ולאמת אסטרטגיות טיפוליות שונות. מספר מחקרים בשנים האחרונות השתמשו בתרביות מרקמת קליפת המוח האנושית הבוגרת (hACtx) כדי למדל מחלות מוח אנושיות 14,15,16,17,18,19; עם זאת, מידע מוגבל זמין בהקשר של טיפול בתאי גזע. שני מחקרים כבר הוכיחו את היתכנות המערכת המתוארת כאן. בשנת 2018, תאי גזע עובריים אנושיים שתוכנתו עם גורמי שעתוק שונים והושתלו ברקמת hACtx הוכחו כמולידים נוירונים קליפתיים בוגרים שיכולים להשתלב ברשתות קליפת המוח האנושיות הבוגרות20. בשנת 2020, השתלת תאי LT-NES במערכת האורגנוטיפית האנושית חשפה את יכולתם להתמיין לנוירונים קליפתיים בוגרים וספציפיים לשכבה עם התכונות האלקטרופיזיולוגיות של נוירונים פונקציונליים. תאי העצב המושתלים יצרו מגעים סינפטיים משפיעים ותוססים עם תאי העצב בקליפת המוח האנושית בפרוסות המוח הבוגרות, כפי שאומתו על ידי מעקב מונוסינפטי מדרדר של נגיף הכלבת, רישומי טלאי של תאים שלמים ומיקרוסקופ אלקטרונים חיסוני21.
Protocol
Representative Results
Discussion
השגת פרוסות hACtx באיכות גבוהה מספיק היא השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה. רקמת קליפת המוח מתקבלת מחולים אפילפטיים שעברו ניתוח כריתה24. איכות הרקמה המנותחת, כמו גם זמן החשיפה של הרקמה בין כריתה לתרבית, היא קריטית; ככל שהרקמה מועברת מהר יותר מחדר הניתוח למעבדה ונחתכת, כך הת…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענקים ממועצת המחקר השבדית, קרן המוח השבדית, הקרן השבדית לשבץ מוחי, אזור Skåne, קרן Thorsten and Elsa Segerfalk והיוזמה הממשלתית השבדית לתחומי מחקר אסטרטגיים (StemTherapy).
Materials
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
Referências
- Kuriakose, D., Xiao, Z. Pathophysiology and treatment of stroke: Present status and future perspectives. International Journal of Molecular Sciences. 21 (20), 7609 (2020).
- Armstrong, M. J., Okun, M. S. Diagnosis and treatment of Parkinson disease: A review. The Journal of the American Medical Association. 323 (6), 548-560 (2020).
- Lindvall, O., Kokaia, Z., Martinez-Derrano, A. Stem cell therapy for human neurodegenerative disorders-How to make it work. Nature Medicine. 10, 42-50 (2004).
- Reubinoff, B. E., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1134-1140 (2001).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 25, 139-151 (2017).
- Tornero, D., et al. Synaptic inputs from stroke-injured brain to grafted human stem cell-derived neurons activated by sensory stimuli. Brain. 140 (3), 692-706 (2017).
- Palma-Tortosa, S., et al. Activity in grafted human iPS cell-derived cortical neurons integrated in stroke-injured rat brain regulates motor behavior. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 117 (16), 9094-9100 (2020).
- Robinson, N. B., et al. The current state of animal models in research: A review. International Journal of Surgery. 72, 9-13 (2019).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Gonzalez-Ramos, A., et al. Human stem cell-derived GABAergic neurons functionally integrate into human neuronal networks. Scientific Reports. 11, 22050 (2021).
- Noraberg, J., et al. Organotypic hippocampal slice cultures for studies of brain damage, neuroprotection and neurorepair. Current Drug Targets. CNS & Neurological Disorders. 4 (4), 435-452 (2005).
- Delavaran, H., et al. Proximity of brain infarcts to regions of endogenous neurogenesis and involvement of striatum in ischaemic stroke. European Journal of Neurology. 20 (3), 473-479 (2013).
- Sabuncu, M. R., et al. The dynamics of cortical and hippocampal atrophy in Alzheimer disease. Archives of Neurology. 68 (8), 1040-1048 (2011).
- Eugene, E., et al. An organotypic brain slice preparation from adult patients with temporal lobe epilepsy. The Journal of Neuroscience Methods. 235, 234-244 (2014).
- Mendes, N. D., et al. Free-floating adult human brain-derived slice cultures as a model to study the neuronal impact of Alzheimer’s disease-associated Aβ oligomers. The Journal of Neuroscience Methods. 307, 203-209 (2018).
- Kalmbach, B. E., et al. Signature morpho-electric, transcriptomic, and dendritic properties of human layer 5 neocortical pyramidal neurons. Neuron. 109 (18), 2914-2927 (2021).
- Barth, M., et al. Microglial inclusions and neurofilament light chain release follow neuronal alpha-synuclein lesions in long-term brain slice cultures. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 54 (2021).
- Almeida, G. M., et al. Neural infection by oropouche virus in adult human brain slices induces an inflammatory and toxic response. Frontiers in Neuroscience. 15, 674576 (2021).
- Schwarz, N., et al. Human cerebrospinal fluid promotes long-term neuronal viability and network function in human neocortical organotypic brain slice cultures. Scientific Reports. 7, 12249 (2017).
- Miskinyte, G., et al. Direct conversion of human fibroblasts to functional excitatory cortical neurons integrating into human neural networks. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 207 (2017).
- Gronning Hansen, M., et al. Grafted human pluripotent stem cell-derived cortical neurons integrate into adult human cortical neural circuitry. Stem Cells Translational Medicine. 9 (11), 1365-1377 (2020).
- Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS One. 7 (1), 29597 (2012).
- Avaliani, N., et al. Optogenetics reveal delayed afferent synaptogenesis on grafted human-induced pluripotent stem cell-derived neural progenitors. Stem Cells. 32 (12), 3088-3098 (2014).
- Engel, J., et al. Practice parameter: temporal lobe and localized neocortical resections for epilepsy. Epilepsia. 44 (6), 741-751 (2003).
- Qi, X. R., et al. Human brain slice culture: A useful tool to study brain disorders and potential therapeutic compounds. Neuroscience Bulletin. 35 (2), 244-252 (2019).
- Verwer, R. W., et al. Injury response of resected human brain tissue in vitro. Brain Pathology. 25 (4), 454-468 (2015).
- Verwer, R. W., et al. Altered loyalties of neuronal markers in cultured slices of resected human brain tissue. Brain Pathology. 26 (4), 523-532 (2016).
- Xu, L., Wang, J., Ding, Y., Wang, L., Zhu, Y. J. Current knowledge of microglia in traumatic spinal cord injury. Frontiers in Neurology. 12, 796704 (2021).
- Jones, R. S., da Silva, A. B., Whittaker, R. G., Woodhall, G. L., Cunningham, M. O. Human brain slices for epilepsy research: Pitfalls, solutions and future challenges. Journal of Neuroscience Methods. 260, 221-232 (2016).
- Schwarz, N., et al. Long-term adult human brain slice cultures as a model system to study human CNS circuitry and disease. Elife. 8, 48417 (2019).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Wang, Z., et al. Organoid technology for brain and therapeutics research. CNS Neuroscience & Therapeutics. 23 (10), 771-778 (2017).
- Wang, H. Modeling neurological diseases with human brain organoids. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 15 (2018).
- Palma-Tortosa, S., Coll-San Martin, B., Kokaia, Z., Tornero, D. Neuronal replacement in stem cell therapy for stroke: Filling the gap. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 662636 (2021).
