Настоящий протокол описывает контролируемые царапины микролезвий на поверхности суставного хряща после дестабилизации колена мыши путем разрезания медиальной минискотибиальной связки. Эта животная модель представляет ускоренную форму остеоартрита (ОА), подходящую для изучения образования остеофита, остеосклероза и боли на ранней стадии.
Остеоартрит является наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательного аппарата у людей старше 45 лет, что приводит к увеличению экономических и социальных издержек. Животные модели используются для имитации многих аспектов заболевания. Настоящий протокол описывает дестабилизацию и модель царапин хряща (DCS) посттравматического остеоартрита. Основываясь на широко используемой модели дестабилизации медиального мениска (DMM), DCS вводит три царапины на поверхности хряща. В настоящей статье освещаются шаги по дестабилизации колена путем перерезания медиальной менискотибиальной связки с последующими тремя преднамеренными поверхностными царапинами на суставном хряще. Также демонстрируются возможные методы анализа методом динамической несущей способности, микрокомпьютерной томографии и гистологии. Хотя модель DCS не рекомендуется для исследований, которые сосредоточены на влиянии остеоартрита на хрящ, она позволяет изучать развитие остеоартрита в более короткое временное окно, уделяя особое внимание (1) образованию остеофита, (2) остеоартритной и травматической боли и (3) эффекту повреждения хряща во всем суставе.
Остеоартрит (ОА) является наиболее распространенным заболеванием опорно-двигательного аппарата у людей старше 45 лет, причем более 8,75 миллиона человек обращаются за лечением в Великобритании1. Растущая распространенность заболевания привела к увеличению экономических и социальных издержек, является одним из основных факторов инвалидности и снижает качество жизни пациентов1. Без доступных методов лечения существует острая необходимость в ускорении исследований, чтобы понять развитие и прогрессирование заболевания. Заболевание является комплексным, а также многофакторным по своей природе. Основными клиническими измерениями заболевания являются боль и подвижность суставов2, а ОА влияет на все ткани в суставе, а не только на хрящ3. Одна из основных проблем в понимании ОА заключается в том, что это может занять годы, иногда десятилетия, от первоначального представления / травмы до прогрессирования симптоматического заболевания с болью и неподвижностью.
Моделирование остеоартрита у грызунов расширило наши знания о патофизиологии ОА, позволив нам понять начало и прогрессирование в гораздо более короткие сроки и с подробным изучением вовлеченных тканей. Существует множество мышиных моделей остеоартрита, от генетически модифицированных животных до моделей хирургического вмешательства. Наиболее широко используемой мышиной моделью посттравматического ОА является дестабилизация медиального мениска (ДММ)4,5. Предостережением модели является изменчивость между различными операторами. Опытные хирурги могут выполнить процедуру с минимальным повреждением суставов, в то время как неопытные операторы обнажают суставную капсулу в течение более длительных периодов времени и наносят ущерб хрящу. Эта изменчивость процесса влияет на тяжесть модели, при этом большее первоначальное повреждение приводит к увеличению показателей повреждения хряща и образованию остеофита. Намереваясь уменьшить вариабельность между операторами и имитировать повреждение хряща от клинического вмешательства, разработана модифицированная версия этой модели, в соответствии с которой наносится контролируемое дополнительное повреждение поверхностной поверхности хряща в виде трех поверхностных царапин6. Это также позволяет моделировать прогрессирование ОА в результате повреждения хряща, вызванного некоторыми клиническими вмешательствами. По сравнению со стандартной моделью DMM, непосредственно индуцированное повреждение хряща приводит к последовательно ускоренному образованию выступающих остеофитов, увеличению повреждения хряща и воспаления, а также измеримой суррогатной боли у самцов мышей.
Эта модель особенно подходит для изучения ранней стадии посттравматического ОА, уделяя особое внимание образованию остеофита, представлению боли (у самцов мышей), синовиту и ранним изменениям параметров кости. Консистенция образования остеофита в этой модели делает целесообразным изучение репарации костей и эндохондрального окостенения, поскольку образование остеофита представляет собой процесс восстановления через эндохондральное окостенение7. Модель также имитирует повреждения, вносимые непосредственно в хрящ во время клинических вмешательств, таких как артроскопические хирургические процедуры, и, таким образом, она также подходит для изучения влияния повреждения хряща на весь сустав.
Для выполнения хирургической индукции посттравматического остеоартрита (ПТОА) настоятельно рекомендуется поддержка со стороны помощника (например, для подготовки мышей, пока оператор фокусируется на операции). Это облегчает асептическую хирургию, тем самым снижая риск инфекций и делая вмешательство более эффективным в больших экспериментах. Легко потерять плоскость фокусировки во время операции, поэтому микроскоп, который включает педали для фокусировки, является ценной особенностью, помогающей поддерживать стерильность на протяжении всей операции. Положение мыши и колена имеет решающее значение. Колено должно быть обращено вверх и достаточно согнуто, чтобы максимизировать открытие пространства коленного сустава, облегчая доступ к связке для введения микробелла, чтобы поцарапать поверхность мыщелка. Идентификация MMTL может быть сложной задачей, особенно когда жировая подушка больше, чем обычно, или есть небольшое кровотечение. Чтобы избежать кровотечений, подтолкните жировую подушку вверх, чтобы предотвратить разрывы и последующее кровотечение. Если жировая подушка большая, это может занять немного больше времени, но терпеливо продолжайте подталкивать ее вверх.
MMTL находится довольно близко к мыщелку большеберцовой кости, поэтому необходимо позаботиться о том, чтобы не травмировать хрящ при расположении нижнего лезвия изогнутых пружинных ножниц под MMTL. Изогнутые лопасти должны быть направлены в сторону медиальной стороны и немного вверх, параллельно мыщелку. Для лучшего секционирования MMTL убедитесь, что ножницы острые. Убедитесь, что мениск может двигаться медиально после перерезания связки, так как иногда остается небольшое крепление, которое нуждается в дальнейшем разрезании. При введении микроблока, чтобы поцарапать мыщелок, он должен быть перпендикулярен мыщелку. Сделайте первую царапину ближе к середине сустава, но позаботьтесь о том, чтобы не повредить переднюю крестообразную связку. Затем двигайтесь в сторону медиальной стороны, а затем позади мениска. Царапины могут быть видны в виде слабых белых линий на хряще. Поскольку мы обычно используем клипсы, начальный разрез выполняется на боковой стороне, поэтому клипсы располагаются на стороне ноги после закрытия раны. Это позволяет избежать зажимов, потирающих колено, когда мышь восстанавливает движение. При использовании швов настоятельно рекомендуется применение подкожных швов. При использовании наружных швов мыши, скорее всего, будут грызть швы и открывать свою рану, что увеличит шансы заражения. Если все сделано правильно, эта операция не должна занимать более 5-10 минут, от разреза до закрытия раны, тем самым сводя к минимуму воздействие хряща и любые дополнительные неконтролируемые повреждения, которые могут возникнуть. После операции мыши очень быстро выздоравливают и почти сразу могут залезть в клетку и нормально передвигаться. Если мыши не активны, следует проконсультироваться с соответствующим специалистом в подразделении.
Для поведенческой оценки боли оценивали динамическую нагрузку. Однако этот метод можно считать менее чувствительным, чем другие вызванные болевые тесты, такие как тест фон Фрея15. Рекомендуется использовать более одного метода для мониторинга и оценки боли. Изменения, наблюдаемые через 2 недели после вмешательства в DCS, хотя и преходящие, указывают на общее снижение нагрузки на ногу ОА по сравнению со здоровой ногой. Таким образом, 2 недели после вмешательства DCS могут быть использованы для оценки ранней остеоартритной или травмированной боли на мышиных моделях. Визуализация минерализованных остеофитов с помощью μCT позволяет проводить трехмерную количественную оценку, которая также может быть сопоставлена с гистологическими разделами12, добавляя еще одно измерение к изучению возникновения и эволюции остеофита. В нашей группе присутствие остеофита было переменным в модели DMM между операторами и внутри них (2,3 ± 1 против 1,2 ± 1, n > 7, P = 0,0183), тогда как индукция DCS надежно приводила к генерации остеофита во всех случаях независимо от оператора (2,6 ± 0,7 против 2,4 ± 0,5, n > 7, P = 0,711). Кроме того, в модели DCS значительно больше и больше остеофитов по сравнению с DMM. Таким образом, DCS является идеальной моделью для изучения образования остеофита. Количественная оценка остеосклероза, ограниченного областью нагрузки субхондральной кости, также является улучшением в обнаружении небольших изменений. Сравнение медиального отсека оперированной ноги с контралатеральной ногой также предлагает способ нормализации по отношению к внутреннему костному фенотипу этой конкретной мыши12. Добавление царапин хряща в модель DCS является контролируемым средством индуцирования сфокусированного повреждения хряща во время операции, что ускоряет многие аспекты заболевания. Одним из последствий экспериментальной процедуры, связанной с преднамеренным повреждением самого хряща, является то, что это артефактное повреждение должно быть исключено или скорректировано в системе классификации хряща. Из-за этого ограничения мы не рекомендуем эту модель, если основной целью исследования является понимание влияния остеоартрита на сам хрящ. Наконец, также настоятельно рекомендуется, чтобы по крайней мере два слепых оценщика оценивали повреждение хряща и синовита. Это подтверждает и усиливает стандартизацию систем подсчета баллов.
Ограничением данного исследования является то, что степень изменчивости всех параметров, сравнивающих модели DCS и DMM, не была полностью оценена. Этот вопрос будет решаться в будущем с помощью более обширных исследований, которые могли бы также включать оценку изменчивости между операторами из разных учреждений.
В заключение, ускоренный патогенез ОА в текущей модели DCS позволяет представлять посттравматическую ОА и обеспечивает мощный и надежный исследовательский инструмент для исследования и выяснения основных патофизиологических механизмов ОА, приводящих к этому хроническому изнурительному заболеванию суставов. Кроме того, это позволяет исследовать ОА в более короткое временное окно, фокусируясь на остеофитогенезе, боли ОА и влиянии повреждения хряща на весь сустав.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы отметить работу Джеммы Чарльзворт и Мэнди Прайор из Ливерпульского университета, которые приобрели изображения μCT, используемые в этой публикации. Работа финансировалась Versus Arthritis (гранты 20199 и 22483). Линетт Даннинг финансировалась Versus Arthritis (грант 20199 года). Кендал Маккалох финансировался стипендией UWS PhD. Кармен Уэса финансировалась Versus Arthritis (гранты 20199 и 22483).
#11 scalpel blade (and scalpel handle). | World precision instruments | 500240 | access the joint capsule |
15° Cutting Angle microsurgical stab knife | MSP | REF7503 | scratch the cartilage |
6-0 vicryl rapide | Any medical supplies provider | – | alternative method to close wound |
Anaesthetic rig | Generic (many different suppliers) | – | |
Antibacterial skin clenser (Hibiscrub) | Amazon | – | To sterilise surgical skin area |
Applicator for 7 mm clips | World precision instruments | 500343 | close the wound |
Balance | Generic (many different suppliers) | – | To weigh mouse |
Blunt curved forceps | Fine science tools | 500232 | move the patellar ligament to the side |
Buprenorphine (Vetergesic) | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | Analgesia |
CT analyser | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Ctvol | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Data viewer | Bruker | 3D.SUITE software | Software |
Dynamic weight bearing equipment | Bioseb | BIO-DWB-DUAL | Measure limb loading and has cage, pressure matt and software for analysis |
EDTA | Merck | E9884 | 10% solution in PBS (or water) to decalcify bone pH 7.4 |
Ethanol | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Fast Green FCF | Merck | F7252 | For staining sections |
Glacial acetic acid | Merck | 1005706 | For stianing sections |
Haematoxylin solution | Merck | GHS132 | Nuclear staining in paraffin sections. |
Hoskins #21 micro-tweezers. | Cameron surgical limited | PHF1085 | move the fat pad |
Isofluorane | Supplied by unit as it is a prescription drug | – | |
Mice | Charles river | – | C57Bl6/J male 8 weeks old (to allow acclimatisation in the unit) |
Microcomputed tomography scanner | Bruker | SKYSCAN 1272 CMOS | µCT |
Micropore surgical paper tape | FisherScientific | 12787597 | hold leg in position |
Paraffin wax | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |
Reflex 7 mm stainless steel wound clips or | Fine science tools | 12032-07 | close the wound |
Remover for 7 mm clips | World precision instruments | 500347 | remove wound clips |
Rotary Microtome | Generic (many different suppliers) | – | To cut section of Paraffin embedded tissue. |
Safranin-O | Merck | S2255 | For staining sections |
Serrated curved forceps | Fine science tools | 15915 | hold the skin |
Sterile Drape | Generic (many different suppliers) | – | To ensure sterility of surgical area |
Sterile Drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | To cover mouse and expose leg |
Sterile saline | Generic (many different suppliers) | ||
Sterile surgical drape | Generic (many different suppliers) | – | maintain sterile environment for surgical tools |
Sterile surgical drape with key hole | Generic (many different suppliers) | – | cover the mouse and keep leg through key hole |
Straight Scissors | World precision instruments | 14393 | open the wound |
Surgical microscope. | Generic (many different suppliers) | – | Adjustable focus. |
Vannas spring scissors with 2 mm blades. | Fine science tools | 15000-04 | cut the MMTL |
Xylene | Generic (many different suppliers) | – | for embedding decalcified bones |