使用慢病毒介导的CRISPR / Cas9基因编辑开发敲除肌肉细胞系
Summary
该协议描述了如何使用CRISPR / Cas9生成敲除肌母细胞，从引导RNA的设计到细胞克隆和敲除克隆的表征。
Abstract
簇状调节间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas 9的一个重要应用是敲除细胞系的开发，专门用于研究在基因诊断期间鉴定的与疾病相关的新基因/蛋白质的功能。对于这种细胞系的开发，必须解开两个主要问题：将CRISPR工具（Cas9和引导RNA）高效插入所选细胞中，以及将Cas9活性限制在所选基因的特定缺失上。这里描述的方案专门用于将CRISPR工具插入难以转染的细胞中，例如肌肉细胞。该协议基于使用慢病毒，用公开可用的质粒生产，其所有克隆步骤都被描述为靶向目的基因。Cas9活性的控制是使用先前描述的称为KamiCas9的系统进行的，其中用编码靶向Cas9的引导RNA的慢病毒转导细胞允许逐步消除Cas9表达。该方案已应用于 RYR1-敲除人肌肉细胞系的开发，该细胞系已在蛋白质和功能水平上进一步表征，以确认参与肌肉细胞内钙释放和激发 – 收缩耦合的这种重要钙通道的敲除。这里描述的过程可以很容易地应用于肌肉细胞或其他难以转染的细胞中的其他基因，并产生有价值的工具来研究人类细胞中的这些基因。
Introduction
随着基因测序的进展和特定组织中未知功能基因突变的鉴定，开发相关细胞模型以了解新靶基因的功能并确认其参与相关病理生理学机制构成了必不可少的工具。此外，这些模型对未来的治疗发展1，2具有重要意义，并且构成了与国际上关于减少在实验中使用动物的建议直线开发敲除动物模型的有趣替代方案。使用CRISPR / Cas9进行基因编辑是目前最强大的工具之一，它允许开发许多敲除/敲入模型，并且使用CRISPR / Cas9进行靶向基因验证是CRISPR / Cas93使用最广泛的应用之一。基因编辑的成功依赖于在靶细胞模型中引入CRISPR工具（引导RNA和核酸酶Cas9）的能力，这在许多难以转染的细胞（如肌肉细胞4）中可能是一个挑战。这种挑战可以通过使用病毒（通常是慢病毒）来克服，其具有有效转译许多细胞类型并递送其转基因的巨大优势。但它的主要缺点是转基因在宿主细胞基因组中的整合，导致定位在整合位点的基因的潜在改变和转基因的永久表达，这在核酸酶Cas9的情况下会导致破坏性后果5。Merienne及其同事6提出了一种智能解决方案，其中包括将靶向Cas9基因本身的引导RNA引入细胞，导致Cas9失活。本文将这种策略的适应性作为用户友好和多功能的方案提出，允许敲除难以转染的细胞中的几乎任何基因。
这里提出的方案的目标是诱导永生化肌肉细胞中目的基因的失活。它可用于敲除不同类型的永生化细胞中的任何目的基因。这里描述的方案包含设计指导RNA并将其克隆成慢病毒质粒的步骤，在慢病毒载体中生产CRISPR工具，用不同的慢病毒转导细胞，以及克隆细胞以产生均匀的编辑细胞系的步骤。
使用该协议，已经开发了永生化的人骨骼肌细胞，并删除了1型ryanodine受体（RyR1），这是一种参与细胞内钙释放和肌肉收缩的必需钙通道7。该基因的敲除（KO）已使用蛋白质印迹在蛋白质水平上得到证实，并且在功能水平上使用钙成像得到证实。
Protocol
Representative Results
Discussion
在表征涉及病理学的未知功能基因的道路上，一个重要的步骤是开发相关的细胞模型来研究这些基因的功能。使用CRISPR / Cas9进行基因编辑是一个呈指数级增长的研究领域，这里介绍的敲除模型的开发是其使用最广泛的应用之一。在这种情况下，我们在这里提出了一种多功能方案，可以在任何感兴趣的基因中开发一种人类细胞系敲除，从而允许在相关的人类细胞模型中表征该基因。这里介绍的方案…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由法国肌病协会（AFM-Téléthon）和奥弗涅-罗纳阿尔卑斯大区（AURA）的赠款资助。
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Referências
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