렌티바이러스 매개 CRISPR/Cas9 유전자 편집을 이용한 녹아웃 근육 세포주 개발
Summary
이 프로토콜은 가이드 RNA의 설계부터 녹아웃 클론의 세포 클로닝 및 특성화에 이르기까지 CRISPR/Cas9를 사용하여 녹아웃 근세포를 생성하는 방법을 설명합니다.
Abstract
클러스터형 조절 간격 짧은 고진구 반복(CRISPR)/Cas 9의 한 가지 중요한 적용은 특히 유전자 진단 중에 확인된 질병과 관련된 새로운 유전자/단백질의 기능을 연구하기 위한 녹아웃 세포주의 개발입니다. 이러한 세포주의 개발을 위해서는 두 가지 주요 쟁점이 얽혀 있어야합니다 : 선택된 세포에 고효율로 CRISPR 도구 (Cas9 및 가이드 RNA)를 삽입하고 선택한 유전자의 특정 결실에 대한 Cas9 활성의 제한. 여기에 기술된 프로토콜은 근육 세포와 같은 형질감염되기 어려운 세포에서 CRISPR 도구의 삽입에 전념한다. 이 프로토콜은 공개적으로 이용가능한 플라스미드로 생산된 렌티바이러스의 사용에 기초하며, 이를 위해 모든 클로닝 단계가 관심있는 유전자를 표적으로 하기 위해 기술된다. Cas9 활성의 조절은 KamiCas9라고 불리는 이전에 기술된 시스템의 적응을 사용하여 수행되었으며, 여기서 Cas9를 표적화하는 가이드 RNA를 코딩하는 렌티바이러스를 사용한 세포의 형질도입은 Cas9 발현의 점진적 폐지를 허용한다. 이 프로토콜은 RYR1-녹아웃 인간 근육 세포주의 개발에 적용되었으며, 이는 근육 세포 내 칼슘 방출 및 여기 수축 결합에 관여하는이 중요한 칼슘 채널의 녹아웃을 확인하기 위해 단백질 및 기능적 수준에서 더욱 특성화되었습니다. 여기에 설명 된 절차는 근육 세포 또는 다른 트랜스펙션하기 어려운 다른 유전자에 쉽게 적용될 수 있으며 인간 세포에서 이러한 유전자를 연구하는 데 유용한 도구를 생산할 수 있습니다.
Introduction
유전자 시퀀싱의 진행과 특정 조직에서 알려지지 않은 기능의 유전자에서 돌연변이의 확인과 함께, 새로운 표적 유전자의 기능을 이해하고 관련 병리 생리학 적 메커니즘에 대한 개입을 확인하는 관련 세포 모델의 개발은 필수적인 도구를 구성합니다. 또한, 이들 모델은 미래의 치료 개발1,2에 매우 중요하며, 실험에서 동물의 사용을 줄이기 위한 국제 권고와 직선으로 녹아웃 동물 모델의 개발에 대한 흥미로운 대안을 구성한다. CRISPR/Cas9를 사용한 유전자 편집은 현재 사용 가능한 가장 강력한 도구 중 하나로, 많은 녹아웃/녹인 모델을 개발할 수 있었으며, CRISPR/Cas9를 사용한 표적 유전자 검증은 CRISPR/Cas93의 가장 널리 사용되는 응용 프로그램 중 하나입니다. 유전자 편집의 성공은 표적 세포 모델에 CRISPR 도구 (가이드 RNAs 및 뉴클레아제 Cas9)를 도입하는 능력에 달려 있으며, 이는 근육 세포4와 같은 많은 형질감염이 어려운 세포에서 도전이 될 수 있습니다. 이 도전은 바이러스, 일반적으로 렌티 바이러스의 사용으로 극복 할 수 있으며, 이는 많은 세포 유형을 효율적으로 형질 도입하고 전이유전자를 전달할 수있는 큰 이점을 가지고 있습니다. 그러나 그것의 주요한 단점은 숙주 세포 게놈에서 이식유전자의 통합이며, 통합 부위에 국소화된 유전자의 잠재적 변경과 이식유전자의 영구적인 발현으로 이어지며, 이는 뉴클레아제 Cas9의 경우 해로운 결과를 초래할 것이다5. Merienne과 동료6에 의해 스마트 솔루션이 제안되었는데, 이는 Cas9 유전자 자체를 표적으로 하는 가이드 RNA의 세포로의 도입으로 구성되어 Cas9 불활성화로 이어진다. 이 전략의 적응은 사용자 친화적이고 다재다능한 프로토콜로 제시되어 형질감염이 어려운 세포에서 거의 모든 유전자를 녹아웃 할 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜의 목표는 불멸화된 근육 세포에서 관심있는 유전자의 불활성화를 유도하는 것이다. 그것은 불멸화 된 세포의 다른 유형에서 관심있는 모든 유전자를 녹아웃하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에 기재된 프로토콜은 가이드 RNAs 및 이들의 클로닝을 렌티바이러스 플라스미드로 설계하고, 렌티바이러스 벡터에서 CRISPR 도구를 생산하고, 세포를 상이한 렌티바이러스로 형질도입하고, 세포를 복제하여 균질한 편집된 세포주를 생산하는 단계를 포함한다.
이 프로토콜을 사용하여, 불멸화된 인간 골격근 세포는 세포내 칼슘 방출 및 근육 수축에 관여하는 필수 칼슘 채널인 제1형 리아노딘 수용체(RyR1)의 결실과 함께 개발되었다7. 유전자의 녹아웃(KO)은 웨스턴 블롯을 사용하여 단백질 수준에서, 그리고 칼슘 이미징을 이용한 기능적 수준에서 확인되었다.
Protocol
Representative Results
Discussion
병리학에 관여하는 알려지지 않은 기능의 유전자를 특성화하는 길의 주요 단계는 이러한 유전자의 기능을 연구하기위한 관련 세포 모델의 개발입니다. CRISPR / Cas9를 사용한 유전자 편집의 사용은 기하 급수적으로 성장하는 연구 분야이며, 여기에 제시된 녹아웃 모델의 개발은 가장 널리 사용되는 응용 분야 중 하나입니다. 이러한 맥락에서, 우리는 여기서 관심있는 임의의 유전자에서 인간 세포?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 협회 Française contre les myopathies (AFM-Téléthon)와 Auvergne-Rhône Alpes Région (AURA)의 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Anti-CACNA1S antibody | Sigma-Aldrich | HPA048892 | Primary antibody |
| Blp I | NE BioLabs | R0585S | Restriction enzyme |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | Transfection kit |
| Easy blot anti Mouse IgG | GeneTex | GTX221667-01 | HRP secondary antibody |
| Easy blot anti Rabbit IgG | GeneTex | GTX221666 | HRP secondary antibody |
| Fluo-4 direct | Molecular Probes | F10472 | Calcium imaging |
| GAPDH(14C10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #2118 | Primary antibody |
| HindIII | Fermentas | ER0501 | Restriction enzyme |
| InFusion HD Precision Plus | Takara | 638920 | Ligation kit |
| MasterMix Phusion High Fidelity with GC | ThermoFisher Scientific | F532L | Mix for PCR reaction with High fidelity Taq polymerase and dNTPs |
| Myosin Heavy Chain antibody | DHSB | MF20 | Primary antibody |
| NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | REF 740424 | Maxipreparation kit for purification of plasmids |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609 | DNA purification |
| NucleoSpin Tissue | Macherey-Nagel | 740952 | Kit for DNA extraction from cell |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | ThermoFisher Scientific | C737303 | Chemically competent cells |
| Plasmid #87904 | Addgene | 87904 | Lentiviral plasmid encoding the SpCas9 (for LV-Cas9) |
| Plasmid #87919 | Addgene | 87919 | Lentiviral backbone for insertion of cassette with guides (for LV-guide-target) |
| Plasmid #12260 | Addgene | 12260 | Lentiviral plasmid encoding lentiviral packaging GAG POL |
| Plasmid #8454 | Addgene | 8454 | Lentiviral plasmid encoding envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
| V5 Tag Monoclonal Antibody | Invitrogene | R96025 | Primary antibody |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | Chemically competent cells |
| Xma I | NE BioLabs | R0180S | Restriction enzyme |
Referências
- Claussnitzer, M., Susztak, K. Gaining insight into metabolic diseases from human genetic discoveries. Trends in Genetics. 37 (12), 1081-1094 (2021).
- Fuster-García, C., García-Bohórquez, B., Rodríguez-Muñoz, A., Millán, J. M., García-García, G. Application of CRISPR tools for variant interpretation and disease modeling in inherited retinal dystrophies. Genes. 11 (5), 473 (2020).
- Modell, A. E., Lim, D., Nguyen, T. M., Sreekanth, V., Choudhary, A. CRISPR-based therapeutics: current challenges and future applications. Trends in Pharmacological Sciences. 43 (2), 151-161 (2022).
- Olson, E. N. Toward the correction of muscular dystrophy by gene editing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (22), (2021).
- Wu, X., Kriz, A. J., Sharp, P. A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system. Quantitative Biology. 2 (2), 59-70 (2014).
- Merienne, N., et al. The self-inactivating KamiCas9 system for the editing of CNS disease genes. Cell Reports. 20 (12), 2980-2991 (2017).
- Marty, I., Fauré, J. Excitation-contraction coupling alterations in myopathies. Journal of Neuromuscular Diseases. 3 (4), 443-453 (2016).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
- Sun, Y., Sriramajayam, K., Luo, D., Liao, D. J. A quick, cost-free method of purification of DNA fragments from agarose gel. Journal of Cancer. 3, 93-95 (2012).
- Flucher, B. E., Conti, A., Takeshima, H., Sorrentino, V. Type 3 and type 1 ryanodine receptors are localized in triads of the same mammalian skeletal muscle fibers. The Journal of Cell Biology. 146 (3), 621-630 (1999).
- Hess, H. H., Lees, M. B., Derr, J. E. A linear Lowry–Folin assay for both water-soluble and sodium dodecyl sulfate-solubilized proteins. Analytical Biochemistry. 85 (1), 295-300 (1978).
- Garibaldi, M., et al. Dusty core disease’ (DuCD): expanding morphological spectrum of RYR1 recessive myopathies. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 3 (2019).
- Marty, I., et al. Biochemical evidence for a complex involving Dihydropyridine receptor and Ryanodine receptor in triad junctions of skeletal muscle. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2270-2274 (1994).
- Oddoux, S., et al. Triadin deletion induces impaired skeletal muscle function. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 34918-34929 (2009).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skeletal Muscle. 1, 34 (2011).
- Cacheux, M., et al. Functional characterization of a central core disease RyR1 mutation (p.Y4864H) associated with quantitative defect in RyR1 protein. Journal of Neuromuscular Diseases. 2 (4), 421-432 (2015).
- Luis, A. The old and the new: Prospects for non-integrating lentiviral vector technology. Viruses. 12 (10), 1103 (2020).
- Leenay, R. T., Beisel, C. L. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. Journal of Molecular Biology. 429 (2), 177-191 (2017).
- Salmon, P., Trono, D. Production and titration of lentiviral vectors. Current Protocols in Neurosciences. , (2006).
