Stratégie pour l’étude des cellules lymphoïdes productrices d’IL-9 dans le modèle d’infection à Nippostrongylus brasiliensis
Summary
Les cellules T et ILC2 exprimant l’IL-9 sont induites au cours de l’infection à N. brasiliensis , mais leur caractérisation a été largement négligée dans l’intestin infecté en raison de leur faible fréquence et de leur cinétique différentielle. Ce protocole décrit l’isolement de ces cellules à partir de différents organes cibles et la confirmation de leur identité par cytométrie en flux à différents stades de l’infection.
Abstract
L’IL-9 est une cytokine pléiotropique associée à divers processus, notamment l’immunité antitumorale, l’induction de pathologies allergiques et la réponse immunitaire contre les infections à helminthes, où elle joue un rôle important dans l’expulsion du parasite. Dans un modèle murin d’infection à Nippostrongylus brasiliensis, l’IL-9 est produite principalement par les lymphocytes T CD4+ et les cellules lymphoïdes innées présentes dans les poumons, l’intestin grêle et les ganglions lymphatiques drainants. Compte tenu des difficultés techniques liées à la coloration intracellulaire de l’IL-9, ainsi que de la complexité de l’isolement des cellules hématopoïétiques de l’intestin grêle lors de l’infection, il existe un besoin urgent d’un protocole complet mais simple pour analyser l’expression de l’IL-9 dans différents tissus lymphoïdes et non lymphoïdes dans ce modèle. Le protocole décrit ici décrit la cinétique de l’IL-9 produite par les lymphocytes T CD4+ et les lymphoïdes innés dans les poumons et l’intestin grêle, les principaux organes ciblés par N. brasiliensis, ainsi que dans les ganglions lymphatiques médiastinaux et mésentériques, tout au long de l’infection. En outre, il détaille le nombre de larves nécessaires à l’infection, en fonction du type de cellule et de l’organe d’intérêt. Ce protocole vise à aider à la normalisation des tests afin d’économiser du temps et des ressources en offrant la possibilité de se concentrer sur les cellules, les organes et les stades spécifiques de la maladie d’intérêt dans le modèle d’infection à N. brasiliensis.
Introduction
Les ankylostomes sont des parasites intestinaux qui infectent environ 700 millions de personnes dans le monde, principalement dans les zones tropicales des pays sous-développés. Les infections de haute intensité à Ancylostoma duodenale et Necator americanus, les parasites de l’ankylostome les plus courants chez l’homme, provoquent une anémie et une carence en protéines pouvant entraîner un retard de croissance et de développement mental1. N. americanus et le parasite rongeur Nippostrongylus brasiliensis induisent une réponse immunitaire prototypique de type 2 chez leur hôte et partagent des similitudes dans leur cycle de vie. Par conséquent, l’infection des souris par N. brasiliensis est le modèle le plus couramment utilisé pour les infections par l’ankylostome humain. Stade 3 (L3) Les larves infectieuses de N. brasiliensis se déplacent de la peau vers les poumons dans les premières heures suivant l’infection. Une fois dans les poumons, ils deviennent L4 et migrent vers le haut de la trachée pour être avalés, traversent l’estomac et atteignent l’intestin pour devenir adultes (L5) dans les 4-5 jours. Dans l’intestin, les vers L5 pondent des œufs qui sont excrétés dans les matières fécales pour relancer le cycle de vie du parasite2.
La réponse immunitaire induite par N. brasiliensis est caractérisée par une augmentation de plusieurs cytokines de type 2, y compris IL-4, IL-5, IL-9, IL-10 et IL-13, ainsi que par une éosinophilie, une basophilie, une hyperplasie caliciforme et mastocytes et une production accrue d’IgG1 et d’IgE. La plupart des études visant à identifier et à définir les réponses immunitaires provoquées lors de l’infection à N. brasiliensis sont centrées sur le rôle de l’IL-4 ou de l’IL-13 dans ce modèle3. Cependant, l’identification et la caractérisation des cellules exprimant l’IL-9 et la fonction de cette cytokine avaient été largement négligées, jusqu’à ce que Licona-Limón et al. publient la première étude démontrant un rôle critique de l’IL-9 dans la réponse immunitaire contre N. brasiliensis. En utilisant des souris rapporteures, cette étude a décrit les cellules T (principalement T auxiliaires 9) et les cellules lymphoïdes innées de type 2 (ILC2) comme les principaux sous-ensembles cellulaires exprimant l’IL-9 lors de l’infection4.
L’isolement et la caractérisation des cellules immunitaires des poumons infectés par des helminthes sont possibles et ont été largement rapportés 3,4. Cependant, en raison du remodelage tissulaire inhérent et de la production de mucus, le faire dans l’intestin infecté s’est avéré être un défi technique, jusqu’à la publication récente de Ferrer-Font et al.5. Le groupe a décrit un protocole pour isoler et analyser les suspensions unicellulaires de sous-ensembles immunitaires provenant d’intestins murins infectés par Heligmosomoides polygyrus. Sur cette base, nous avons maintenant normalisé un protocole d’isolement et d’analyse cytométrique des cellules lymphoïdes exprimant l’IL-9 de l’intestin infecté par N. brasiliensis. En outre, nous avons établi la cinétique IL-9 à partir de différentes sources cellulaires et emplacements anatomiques tout au long de l’infection.
La caractérisation des populations cellulaires distinctes impliquées dans cette infection est essentielle pour une meilleure compréhension de la réponse immunitaire au parasite et de son interaction avec l’hôte. Ce protocole complet fournit une voie claire pour isoler et analyser les cellules productrices d’IL-9 des organes souhaités aux stades d’intérêt de la maladie, permettant une nette amélioration des connaissances sur le rôle de ces cellules dans l’infection à N. brasiliensis et les infections parasitaires en général.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une compréhension complète des interactions parasite-hôte intestinal et des réponses immunitaires à l’infection par les helminthes nécessite l’identification et l’analyse des différentes populations cellulaires et molécules effectrices qui sont essentielles pour l’induction du remodelage tissulaire et l’expulsion des vers. Les géohelminthiasies représentent un gros problème dans les pays en développement du monde entier. Cependant, jusqu’à récemment, un protocole permettant d’analyser les popu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier José Luis Ramos-Balderas pour son soutien technique. Ce travail a été soutenu par la subvention suivante à PLL de CONACYT (FORDECYT-PRONACE-303027). OM-P et EO-M ont reçu une bourse du CONACYT (736162 et 481437, respectivement). MCM-M a reçu une bourse du CONACYT (Estancias Posdoctorales por México 2022 (3)).
Materials
| ACK buffer | Homemade | ||
| Attune Nxt cytometer | Thermofisher | ||
| B220 | Biolegend | 103204 | |
| CD11b | Biolegend | 101204 | |
| CD11c | Biolegend | 117304 | |
| CD19 | Biolegend | 115504 | |
| CD4 | Biolegend | 100404 | |
| CD4 (BV421) | Biolegend | 100443 | |
| CD45.2 | Biolegend | 109846 | |
| CD8 | Biolegend | 100703 | |
| CD90.2 | Biolegend | 105314 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| DNAse I | Invitrogen | 18068015 | Specific activity: ≥10 000 units/mg |
| Facs ARIA II sorter | BD Biosciences | ||
| FACS Melody cell sorter | BD Biosciences | ||
| Fc-Block | Biolegend | 101320 | |
| FcεRI | eBioscience | 13589885 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| FlowJo | FlowJo | Flow cytometry analysis data software | |
| Gr-1 | Tonbo | 305931 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Homemade | ||
| IL-9 | biolegend | 514103 | |
| NK1.1 | Biolegend | 108704 | |
| Nylon mesh | lba | B07HYHHX5V | |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | |
| Phosphate-buffered saline | Homemade | ||
| RPMI | Gibco | 11875093 | |
| Siglec F | Biolegend | 155512 | |
| Streptavidin | Biolegend | 405206 | |
| TCR-β | Biolegend | 109203 | |
| TCR-β (PE/Cy7) | Biolegend | 109222 | |
| TCR-γδ | Biolegend | 118103 | |
| Ter119 | Biolegend | 116204 | |
| Tricine buffer | Homemade | ||
| Zombie Aqua Fixable Viability Dye | Biolegend | 423101 |
Referências
- Centers for Disease Control and Prevention. . Parasites – Hookworm. , (2022).
- Camberis, M., Le Gros, G., Urban, J. Animal model of Nippostrongylus brasiliensis and Heligmosomoides polygyrus. Current Protocols in Immunology. , (2003).
- Mearns, H., et al. Interleukin-4-promoted T helper 2 responses enhance Nippostrongylus brasiliensis-induced pulmonary pathology. Infection and Immunity. 76 (12), 5535-5542 (2008).
- Licona-Limon, P., et al. Th9 cells drive host immunity against gastrointestinal worm infection. Immunity. 39 (4), 744-757 (2013).
- Ferrer-Font, L., et al. High-dimensional analysis of intestinal immune cells during helminth infection. Elife. 9, 51678 (2020).
- Kharwadkar, R., et al. Expression efficiency of multiple IL9 reporter alleles Is determined by cell lineage. Immunohorizons. 4 (5), 282-291 (2020).
- Wilhelm, C., et al. An IL-9 fate reporter demonstrates the induction of an innate IL-9 response in lung inflammation. Nature Immunology. 12 (11), 1071-1077 (2011).
- Gerlach, K., et al. TH9 cells that express the transcription factor PU.1 drive T cell-mediated colitis via IL-9 receptor signaling in intestinal epithelial cells. Nature Immunology. 15 (7), 676-686 (2014).
- Olson, M. R., et al. Paracrine IL-2 is required for optimal type 2 effector cytokine production. Journal of Immunology. 198 (11), 4352-4359 (2017).
- Cold Spring Harbor Protocols. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Pinto, M. E. S., Licona-Limon, P. Th9 cells and parasitic inflammation: Use of Nippostrongylus and Schistosoma models. Methods in Molecular Biology. 1585, 223-245 (2017).
- Lawrance, C. C., Lucas, E. A., Clarke, S. L., Smith, B. J., Kuvibidila, S. Differential effects of isoflurane and CO2 inhalation on plasma levels of inflammatory markers associated with collagen-induced arthritis in DBA mice. International Immunopharmacology. 9 (7-8), 807-809 (2009).
- Boivin, G. P., Bottomley, M. A., Schiml, P. A., Goss, L., Grobe, N. Physiologic, behavioral, and histologic responses to various euthanasia methods in C57BL/6Ntac male mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (1), 69-78 (2017).
- old Spring Harbor Protocols. Hank’s balanced salt solution (HBSS) without phenol red. Cold Spring Harbor Protocols. , (2006).
- Bielecki, P., et al. Skin-resident innate lymphoid cells converge on a pathogenic effector state. Nature. 592 (7852), 128-132 (2021).
- Sanjabi, S., Mosaheb, M. M., Flavell, R. A. Opposing effects of TGF-beta and IL-15 cytokines control the number of short-lived effector CD8+ T cells. Immunity. 31 (1), 131-144 (2009).
- Liu, H., Li, M., Wang, Y., Piper, J., Jiang, L. Improving single-cell encapsulation efficiency and reliability through neutral buoyancy of suspension. Micromachines. 11 (1), 94 (2020).
- Huang, Y., et al. IL-25-responsive, lineage-negative KLRG1(hi) cells are multipotential ‘inflammatory’ type 2 innate lymphoid cells. Nature Immunology. 16 (2), 161-169 (2015).
- Huang, Y., et al. S1P-dependent interorgan trafficking of group 2 innate lymphoid cells supports host defense. Science. 359 (6371), 114-119 (2018).
- Flamar, A. L., et al. Interleukin-33 induces the enzyme Tryptophan hydroxylase 1 to promote inflammatory group 2 innate lymphoid cell-mediated immunity. Immunity. 52 (4), 606-619 (2020).
- Olguín-Martínez, E., et al. IL-33 and the PKA pathway regulate ILC2 populations expressing IL-9 and ST2. Frontiers in Immunology. 13, 787713 (2022).
- Olguin-Martinez, E., Ruiz-Medina, B. E., Licona-Limon, P. Tissue-specific molecular markers and heterogeneity in type 2 innate lymphoid cells. Frontiers in Immunology. 12, 757967 (2021).
- Noelle, R. J., Nowark, E. C. Cellular sources and immune functions of interleukin-9. Nature Reviews. Immunology. 10 (10), 683-687 (2010).
